テトラサイクリン排出蛋白の分子構造と機能に関する研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454619
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 山口 明人 千葉大学, 薬学部, 助教授 (60114336)
• キーワード: 薬剤排出 / 薬剤耐性 / テトラサイクリン / 部位特異変異導入 / アンチポーター

研究概要

1990年以後、細菌において薬剤排出蛋白が続々と発見されるようになり、薬剤排出蛋白の中で唯一分子機構の解析が進んでいるテトラサイクリン排出蛋白のモデルとしての意義が急速に高まっている。本研究においては、主として遺伝子工学的方法により、テトラサイクリン排出蛋白の輸送機構の解明を行った。
糖やアミノ酸などの栄養物質の輸送系から、薬剤の排出蛋白にいたるまで、広く保存されている配列モチーフの存在が知られていた。これは、GXXSDRXGRRと表される。このモチーフの役割は不明である。本研究では、テトラサイクリン排出蛋白を素材として初めてこのモチーフの部位特異変異導入による解析を行った。その結果、モチーフ5番目のAsp66と9番目のArg70のそれぞれ正負両荷電が輸送機能に必須であることがわかった。Arg70については、Lys変異体が輸送活性を野性型の1/3程度残しているのにたいし、中性や産生残基への置換体がすべてほとんど輸送活性を消失していた中で、Cys変異体はLys変異体と比較できる程度の輸送活性を残存していた。これは、Co^<2+>のような2価カチオンがCysとメルカプチドを形成して正荷電残基として働くためであることが証明された。
このモチーフのある細胞質側ループ_<2-3>の10残基それぞれのCys置換体の中で、活性の無いCys62とCys66を除き、SH試薬NEMで阻害されるのはCys65およびCys70のみであった。これらへのNEMの結合は基質の存在により促進された。つまり、細胞質側ループの露出度が基質により高まることが示された。逆に、ペリプラズム側Leu97→Cys変異体へのNEM結合は基質により阻害され、露出度が低下することがわかった。これは、テトラサイクリン排出蛋白が基質により、inside-open/outside-closedの構造になることを示している。

研究成果

• [文献書誌] A.Yamaguchi: "Metal-tetracycline/H^+ antiporter of Escherichia coli.." J.Biol.Chem.268. 6496-6504 (1993)
• [文献書誌] A.Yamaguchi: "Roles of the conserved quartets of residues located.." Biochemistry. 32. 5698-5704 (1993)
• [文献書誌] A.Yamaguchi: "Hot spot for sulfhydryl inactivation of Cys mutants.." J.Biochem.115. 958-964 (1994)
• [文献書誌] Y.Someya: "Site-specificity of the second-site suppressor mu-..." Biochemistry. 34. 7-12 (1995)
• [文献書誌] T.Kimura: "Substrate-induced acceleration of N-ethylmaleimide.." FEBS Lett.(in press). (1995)
• [文献書誌] Y.Someya: "A novel glycylcycline,9- (N,N-dimethylglycylamido) -.." Antimicrob.Agents Chemother.39. 247-249 (1995)
• [文献書誌] 橋本一,井上松久 編: "病原菌の薬剤耐性:機構の解明とその対策" 学会出版センター, 200 (1993)