血栓形成阻止因子の特異機能発現における分子内機能ドメインの役割の解明-構造・機能相関に関する分子生物学的解析-

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454622
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 鈴木 宏治 三重大学, 医学部, 教授 (70077808)
• 研究分担者: 林 辰弥 三重大学, 医学部, 助手 (00242959) ; 武谷 浩之 三重大学, 医学部, 助手 (60222105)
• キーワード: トロンボモジュリン / プロテインC / トロンビン / 機能ドメイン / EGF様ドメイン / 血管内皮細胞 / ホモシステイン / 遺伝子発現機構

研究概要

我々は平成5年度、血液凝固系のkey enzymeのX因子およびプロトロンビンの活性化における分子内機能ドメインの役割について検討を行い、以下のような知見を得た。
(1)X因子はIXa因子による活性化の際に、H鎖のN末端領域の活性化ペプチド(Factor X activation peptide:XAP)が切断される。今回、IXa因子によるX因子の活性化に及ぼすXAPの影響を検討した。活性化Xa因子のゲル濾過法による検討から、XAPはX因子の活性化後もCa^<2+>依存性にXa因子と結合していることが示された。XAPはリン脂質存在下でのIXa因子によるX因子の活性化を阻害した。固相化XAPにIXa因子は特異的に結合した(Kd=47 nM)。固相化IXa因子へのX因子の結合に対する阻害実験から、X因子のXAP領域はIXa因子との結合に重要であるが、活性化後のXa因子のXAPはIXa因子との結合には関与しないことが示唆された。また、シアリダーゼ処理XAPによるIXa因子のX因子活性化の阻害活性が低下したことから、XAPのシアル酸はIXa因子との結合に関与していることが示唆された。
(2)プロトロンビンはXa因子によって分子内の2ケ所が切断されて活性化されるが、この際にトロンビンとともにGlaドメインとクリングル1ドメインを含むフラグメント1およびクリングル2ドメインを含むフラグメント2が遊離される。本研究では、Xa因子によるプロトロンビンの活性化の際のこれらのフラグメントの役割を検討した。その結果、Xa因子によるプロトロンビンの活性化はフラグメント2によって特異的、拮抗的に阻害された。固相化フラグメント2に対してXa因子は特異的に結合し(Kd=90 nM)、この結合はCa^<2+>およびリン脂質に依存した。即ち、クリングル2ドメインはXa因子との相互作用部位であることを明らかにした。次にクリングル2領域をさらに酵素消化し、Xa因子との相互作用部位をHis(205)-Arg(220)と決定した。これに対応して、Xa因子側のGlaドメインがクリングル2と相互作用することが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Hayashi,T.,Nishioka,J.,Suzuki,K.,et al.: "Protein S Tokushima:abnormal molecule with a substitution of Glu for Lys-155 in the second epidermal growth factor-like domain of protein S." Blood. 83. (1994)
• [文献書誌] Shigekiyo,T.,Uno,Y.,Suzuki,K.,et al.: "Protein S Tokushima:an abnormal protein S found in a Japanese family with thrombosis." Thromb.Haemostas.70. 244-246 (1993)
• [文献書誌] Hayashi,T.and Suzuki,K.: "Gene organization of human protein C inhibitor,a member of SERPIN family proteins encoded in five exons." Int.J.Hematol.58. 213-224 (1993)
• [文献書誌] Ido,M.,Ohiwa,M.,Suzuki,K.,et al.: "A compound heterozygous protein C deficiency with a single nucleotide G deletion encoding gly-381 and an amino acid substitution of Lys for Gla-26." Thromb.Haemostas.70. 636-641 (1993)
• [文献書誌] Ito,T.,Hiraiwa,J.,Nishioka,J.,Suzuki,K.: "Characterization of functionally important regions of tissue factor by using monoclonal antibodies." J.Biochem.114. 691-696 (1993)
• [文献書誌] Wada,H.,Mori,Y.,Suzuki,K.,et al.: "Elevated plasma levels of vascular endothelial cell markers in patients with hypercholesterolemia." Am.J.Hematol.44. 112-116 (1993)
• [文献書誌] Suzuki,K.: "Molecular Biology of Thrombosis and Hemostasis.(Protein S.)" Marcel Dekker,New York(eds.by Roberts,H.R.and High,K.A.), (1993)
• [文献書誌] Suzuki,K.: "Methods in Enzumology.(Protein C inhibitor.)" Academic Press,New York(eds.by Lorand,L and Mann,K.G.), 613(15) (1993)