| 研究課題/領域番号 |
05454624
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| 研究機関 | 姫路工業大学 |
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研究代表者 |
小出 武比古 姫路工業大学, 理学部, 教授 (60018695)
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| 研究分担者 |
徳永 文稔 姫路工業大学, 理学部, 助手 (00212069)
若林 貞夫 姫路工業大学, 理学部, 助教授 (80148436)
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| キーワード | プロテインC / ワ-ファリン / ビタミンK / 293細胞 / BHK細胞 / 分泌異常 / 小胞体内分解 / 品質管理機構 |
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| 研究概要 |
[目的]血液凝固因子のプロトロビン、VII、IX、X因子やプロテインC(PC)、プロテインSはそのN末端ドメインに存在するγ-カルボキシグルタミン酸(Gla)の生合成にビタミンK(VK)を必要とする。ワ-ファリンはVKの拮抗剤で抗血栓薬として臨床応用されているが、ワ-ファリン投与の際ヒトでは、PCやVII因子の血中濃度が著減する。本年は、ワ-ファリンのPC分泌への影響を調べる目的で、ヒト腎臓由来293細胞またはBHK細胞にPC遺伝子を導入し、VKまたはワ-ファリンの存在下でPCの分泌量及び分泌速度を調べた。
[方法と結果](1)293細胞で一過性発現を行い、48時間後の細胞抽出液(CE)と培養液中(CM)に分泌されたPC量をELISA法で測定した。その結果、VK存在下ではCEに1.8ng、CMに172ng検出されるが、ワ-ファリン存在下では前者に比べ、CEに231%、CMに26.5%の抗原量が測定され、細胞内にやや蓄積され、分泌は1/4量であった。(2)パルスチェイス実験の結果、VK存在下では293細胞で8時間後、BHK細胞で6時間後にはラベルされた全分子が分泌されるのに対し、ワ-ファリン存在下では細胞内PCの減少を補完する量の分泌が見られず、総放射線量は293細胞で24時間後には元の30%に、BHK細胞で6時間後には23%に減少した。(3)小胞体からゴルジ体への移行を阻害するブレフェルディンAやリソソームプロテアーゼの阻害剤である塩化アンモニウムやロイペプチンはこの減少を阻害しなかった。(4)ワ-ファリン存在下のPCは、二重免疫蛍光染色よりプロテインジスルフィドイソメラーゼと同所にあることやエンドグリコシダーゼH処理により細胞内PCバンドが低分子化することから小胞体に局在する。(5)ワ-ファリンはPCの転写・翻訳には影響しなかった。本研究の結果から、ワ-ファリン投与下で合成されたPCはquality control機構により小胞体内で分解されることが明らかになった。
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