シトクロムP450と白血球NADPHオキシダーゼ反応における酸素活性化機構

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454631
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 石村 巽 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40025599)
• 研究分担者: 江川 毅 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10232935) ; 三木 秀穂 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (90229667) ; 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80095611) ; 広瀬 忠明 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60051405)
• キーワード: シトクロムP450 / 酸素の活性化 / 活性酸素 / オキシゲナーゼ / 酸素添加酵素 / 部位特異的アミノ酸置換 / Site-directed mutagenesis / NADPHオキシダーゼ

研究概要

シトクロムP450による酸素(O_2)の活性化機構を解明するため、活性部位のアミノ酸を非天然型アミノ酸で置換した酵素の合成を試みこれに成功した。即ち、Norenら(Science244,182,1989)の方法に準拠してin vitro翻訳系と合成アミノアシルt-RNAを用いた蛋白合成を行い、242threonineをO-methyl threonineで置換した標品を作成し、その酵素活性、吸収スペクトルなどの性質を調べたところ、-OH基が-O-CH_3基になっているのでプロトンの供与は不可能であるにもかかわらず、予想に反して高いモノオキシゲナーゼ活性を示した。この事実は、これまで我々ならびにS.Sligarらが提唱していたプロトン供給機構を否定するものであり、故に水分子の関与する新しい機構・経路の可能性を提唱した(Kimata,Y.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.1995,in press)。242threonineと357cysteinを各々homoserineとselenocysteinで置換した標品の合成も行い、それらの性質を解明中である。非天然アミノアシルt-RNAの大量化学合成は広瀬、三木が、in vitro翻訳系を用いての蛋白合成は島田、石村が行った。シトクロムP450反応のおける未知の反応中間体の追求を昨年度に組立てたRapid scan absorptionspectrophotometerを用いて、江川、石村らが行い、低スピン酸化型シトクロムP450camとメタクロロ過安息酸との反応時に新しい反応中間体の捕捉に成功し、これをFerryl oxocation radical(Compound I)と同定した。NADPHオキシダーゼによる酸素活性化については、金ヶ崎らとともに貪食球のみならずリンパ球の一種も活性酸素生成能をもつことなどを見い出した。

研究成果

• [文献書誌] Ishimura,Y.,Mitani,F.他4名: "A novel cell layer without corticosteroid synthesizing enzymes in rat adrenal cortex:Histochemical detection and possible physiologoc role" Endocrinology. 135. 431-438 (1994)
• [文献書誌] Egawa,T.,Shimada,H.,and Ishimura,Y.: "Evidence for compound I formation in the reaction of cytochrome P450cam with m-chloroperbenzoic acid" Biochem.Biophys.Res.Commun.201. 1464-1469 (1994)
• [文献書誌] Ishimura,Y.,Miki,H.他7名: "Prostaglandin E1 abrogates early reductive stress and zone-specific paradoxical oxidative injury in hydroperfused rat liver" J.Clin.Invest.93. 155-164 (1994)
• [文献書誌] Ishimura,Y.,Unno,M.他2名: "High-pressure flash photolysis study of hemoprotein:Effects of substrate analogues on the recombination of carbon monoxide to cytochrome P450cam" Biochemistry. 33. 9762-9768 (1994)
• [文献書誌] Ishimura,Y.,Suematsu,M.,他4名: "Carbon monoxide as an endogenous modulator of hepatic vascular perfusion" Biochem.Biophys.Res.Commun.205. 1333-1337 (1994)
• [文献書誌] Kimata,Y.,Shimada,H.,Hirose,T.,and Ishimura,Y.: "Role of Thr-252 in cytochrome P450cam:A study with unnatural amino acid mutagenesis" Biochem.Biophys.Res.Commun.,in press. (1995)
• [文献書誌] Mukai,K.,Shimada,H.,and Ishimura,Y.: "Cytochrome P450;Biochemistry,Biophysics and Molecular Biology(M.Lechner,Editor)" John Libbey Eurotext,Paris,France, 915 (1994)
• [文献書誌] Ishimura,Y.,Makino,R.,他3名: "Frontiers of reactive oxygen species in biology and medicine(Asada,K.,and Yoshikawa,T.,editors)" Elsevier Science B.V., 569 (1994)