機能相補クローニング法による新たな細胞周期制御遺伝子群の単離と機能解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05454647
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)
• 研究分担者: 小野 泰子 大阪大学, 微生物病研究所, 文部技官 (70194602)
• キーワード: 細胞周期 / 機能相補クローニング / cDNAライブラリー / cdc2 / cdc13 / cdc10 / 転写因子 / 減数分裂

研究概要

(1)ベクターの開発とcDNAライブラリーの作製
本年度はまず高効率な機能相補クローニングのための独自のベクター系を作製した。分裂酵母で発現させるためSV40プロモーター、flオリジン、T3/T7RNAポリメラーゼプロモーター、独自のマルチクローニングサイト、ARS、LEUマーカーなどを持つベクター(pLZ3)を作製した。パン酵母で機能発現させるためInvitrogen社のpYES3に独自のマルチクローニングサイトを挿入したものを作製した(pSY3およびpRY3)。これらはUra3,2μ ori,fl ori,GAL1,Ampなどの遺伝子やマーカーを持つ。これらをベクターとして独自に工夫したリンカープライマー法により各種のcDNAライブラリーを作製した。
(2)cdc10などを宿主とした機能相補クローニング
cdc10を宿主として分裂酵母cDNAライブラリーより単離したres1はパン酵母のSW14にアミノ酸が類似したアンキリンモチーフを2つ持つ蛋白質をコードし,Cdc10と複合体を構成する新規転写因子であった。亜鉛フィンガー1個とCDC36(パン酵母のG1変異株)類似配列を持つ蛋白質をコードし,そのmRNAは減数分裂に伴って大量に転写され始めるrep1はpremeiotic DNA synthesisの過程に重要な働きをすることがわかった。パン酵母から単離されたHAC1はゲルシフト法によっても証明できたようにbZIP型のCREB-likeな転写因子をコードする。その破壊株はカフェイン感受性を示しそのmRNAはG1期に転写量が増大する。cdc2,cdc13変異株を相補するヒト由来の13B68は、核マトリックス蛋白質(マトリン)モチーフを持ち同時に減数分裂過程の変異株pat1をも相補する。RNA結合蛋白質モチーフを2個ずつ持つscr2とscr3はcdc2の翻訳を誘導することで相補していることが分かった。

研究成果

• [文献書誌] Tamura K,......,Nojima H & Okayama H.: "Cyclin G:a new mammalian cyclin with homology to fission yeast Cigl." Oncogene.8. 2113-2118 (1993)
• [文献書誌] Kobori M & Nojima H: "A simple treatment of DNA in a ligation mixture prior to electroporation improves transformation frequency." Nucleic Acids Research. 21. 2782-2782 (1993)
• [文献書誌] Ishii T,...,Nojima H & Oda K.: "Differential activation of cyclin and cyclin-dependent kinase genes by ElA_<12S> cDNA product." Experimental Cellular REsearch. 208. 407-414 (1993)
• [文献書誌] Matsuo K,.....,Nojima H & Takano T.: "Expression of the rat calmodulin gene II in the central nervous system:a 294-base promotor and 68-base leader segment....." Molecular Brain Research. 20. 9-20 (1993)
• [文献書誌] Hara E,Yamaguchi T,Nojima H,..., & Oda K.: "Id-related genes encoding helix-loop-helix proteins are required for G1 progression and are repressed in senescent human...." Journal of Biological Chemistry. 269. 2139-2145 (1993)
• [文献書誌] Yoko-o T,..,Nojima H,Uno I & Toh-e A.: "The putative phosphoinositide-specific phospholipase C gene,PLC1,of the yeast S.cerevisiae is important for cell growth." Proceedings of National Academy of Sciences,USA.90. 1804-1808 (1993)