結晶構造解析とタンパク質工学を基盤としたコレステロールの臨床検査用酵素の開発研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05555223
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 広島大学, 工学部, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 曽我部 行博 東洋紡績株式会社, バイオ研究所, 主席研究員 ; 平山 令明 東海大学, 開発工学部, 教授 (70238393) ; 山下 光雄 広島大学, 工学部, 助手 (40220347)
• キーワード: コレステロール / 臨床検査用酵素 / タンパク質工学 / 結晶構造解析 / コンピュータグラフィックス

研究概要

本研究は、成人の健康指標とされているコレステロール値の測定に使用される、コレステロール酸化酵素を遺伝子工学、タンパク質工学、タンパク質結晶解析学、及び酵素生産の立場から研究している研究者が共同で、長期使用に耐えられる安定な酵素に改良することを目的とした。本年度は以下の研究成果が得られた。
1。タンパク質工学技術による放線菌酵素の大腸菌での高発現:放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で大量発現させた(室岡、山下)。大腸菌で発現した、コレステロール酸化酵素は、基質特異性は放線菌と同じであったが、熱に安定となり、pHもアルカリ側で安定となっていた。大腸菌で作られた酵素は、アミノ末端側が長くなり、放線菌で発現した酵素より、耐熱性になっていることが解った。現在この改良型酵素の工業生産に向けての開発が検討されている。
2。試験管内変異による酵素の構造と機能モデルの構築:ランダム変異および指定位置変異により、熱安定性および活性部位に関与するアミノ酸配列を決定した。FAD結合、基質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を予測し(平山)、これらアミノ酸の置換を行った。(室岡、山下)。
3。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製した(曽我部)。この試料を用いて結晶化条件を検討し、X線結晶解析用の結晶を育てている(平山)。
4。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の一部を切り出して、Macintoshで画面表示できるソフトを昨年開発したが、このものをさらに改良し、パソコンで解析できるようにした(平山)。

研究成果

• [文献書誌] Molnar,Istvan: "Bacterial cholesterol oxidases are able to act as flavoprotein-linked keto steroid monooxygenases that catalyse the hydroxylation of cholesterol to 4-cholesten-6-ol-3-one" Molecular Microbiology. 7. 419-428 (1993)
• [文献書誌] Molnar,Istvan: "Nucleotide sequence analysis of a region upstream of the cholesterol oxidase-cytochrome P450 operon of Streptomyces sp.SA-COO revealing repeating units coding for putative transmembrane and DNA-binding proteins" Journal of Fermentation and Bioengineering. 76. 257-264 (1993)
• [文献書誌] Molnar,Istvan: "Helix-turn-helix DNA-binding motifs of Streptomyces-a cautionary note" Molecular Microbiology. 8. 783-787 (1993)
• [文献書誌] Molnar,Istvan: "Molecular cloning,expression in Streptomyces lividans,and analysis of a gene cluster from Arthrobacter simplex encoding 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase,3-ketosteroid-Δ5isomerase,and a hypothetic regulatory protein." Molecular Microbiology. (印刷中). (1995)
• [文献書誌] Choi,Kwang-Pil: "Secretory overproduction of Arthrobacter simplex 3-ketosteroi-Δ1-dehydrogenase by Streptomyces lividans with a multicopy shuttle vector." Appl.Microbiol.Biotechnol.(印刷中). (1995)
• [文献書誌] Choi,Kwang-Pil: "Purification and characterization of the 3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase of Arthrobacter simplex cloned and produced in Streptomyces lividans." Journal of Biochemistry. (印刷中). (1995)
• [文献書誌] Murooka,Yoshikatsu: "Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications" Marcel Dkker,Inc.New York,U.S.A., 904 (1994)
• [文献書誌] Murooka,Yoshikatsu: "Cucumis sativus I,.(Cucumber):In vitro culture and the production of ascorbate oxidase" Biotechnology in Agriculture and foresty Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 15 (1993)