結晶構造解析とタンパク質工学を基盤としたコレステロールの臨床検査用酵素の開発研究

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05555223
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 大阪大学, 工学部, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 曽我部 行博 東洋紡績, バイオ研究所, 主席部員 ; 平山 令明 東海大学, 開発工学部, 教授 (70238393) ; 山下 光雄 大阪大学, 工学部, 助手 (40220347)
• キーワード: コレステロール / 臨床検査用酵素 / タンパク質工学 / コンピュータグラフィックス / 酵素活性部位 / 酵素の耐熱性

研究概要

本研究は、成人の健康指標とされているコレステロール値の測定に使用される、コレステロール酸化酵素を遺伝子工学、タンパク質工学、タンパク質結晶解析学、及び酵素生産の立場から研究している研究者が共同で、長期使用に耐えられる安定な酵素に改良することを目的とした。本年度は以下の研究成果が得られた。
1。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の全部および一部を拡大して、パソコンで画面表示できるソフトを完成させた(平山)。
2。試験管内変異による酵素の構造と機能の解明:FAD結合、基質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を、上記で開発したコンピュタ-グラフィックにより予測し(平山)、これらアミノ酸の置換を部位特異的変異法により行った。(室岡、山下)。その結果、ステロール基質およびFADの結合部位に関与するアミノを明らかにした。基質との親和性の向上した変異酵素も得られた。
3。酵素の耐熱性への改良:先に、放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で大量発現させた(室岡、山下)。N末端部位を延長し、さらに変異をかけたところ、コレステロール酸化酵素は、熱に大幅に安定となったコレステロール酸化酵素に改良することに成功した。大腸菌で大量発現させることにも成功し、現在、この改良型酵素の工業生産に向けての開発が検討されている。
4。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製し(曽我部)、この試料を用いて結晶化条件を検討し、現在、X線結晶解析用の結晶が育ってきている(平山)。
このように、3年間で当初目的を達成し、100%以上の成果を上げることができた。

研究成果

• [文献書誌] Molnar,Istvan: "Molecular cloning,expression in Streptomyces lividans,and analysis of a gene cluster from Arthrobacter simplex encoding 3-ketosteroid-Δ^1-dehydrogenase,3-ketosteroid-Δ^5isomerase,and a hypothetic regulatory protein." Molecular Microbiology. 15. 895-905 (1995)
• [文献書誌] Wilmanska,Danuta: "Identification of cholesterol oxidase from fast-growing Mycobacterial strains and Rhodococcus sp." Journal of Fermentation and Bioengineering. 79. 119-124 (1995)
• [文献書誌] Nomura,Nobuhiko: "Genetic modification of the Streptomyces cholesterol oxidase gene for expression in Escherichia coli and development of promoter-probe vectors for use in enteric bacteria" Journal of Fermentation and Bioengineering. 79. 410-416 (1995)
• [文献書誌] Choi,Kwang-Pil: "Secretory overproduction of Arthrobacter simplex 3-ketosteroi-Δ^1-dehydrogenase by Streptomyces lividans with a multicopy shuttle vector." Applied Microbiology and Biotechnology. 43. 1044-1049 (1995)
• [文献書誌] Choi,Kwang-Pil: "Purification and characterization of the 3-ketosteroid-Δ^1-dehydrogenase of Arthrobacter simplex cloned and produced in Streptomyces lividans." Journal of Biochemistry. 117. 1043-1049 (1995)