研究概要 |
従来、遺伝子の転写調節機構は、その5'端上流にある転写制御領域の下流にβ-GAL,CAT,Luciferase等酵素の遺伝子をレポータとして繋いだDNAを外来性に導入し、発現した酵素活性や抗原性を検出して解析されてきた。しかし、これらの方法では、転写活性を検出した細胞について生理的機能を解析することができない。イオンチャネルは、生細胞で実時間で電気的に定量しうる膜蛋白であり、特に受容体チャネルはアゴニスト依存性に開き、細胞内イオン濃度変化を蛍光指示薬等により非侵襲的に測定できる。当研究ではホヤ胚割球をモデル系として、チャネルの翻訳領域を各種遺伝子の転写制御領域に連結して発現させ、細胞の応答を電気-光学的手法により検出し、非侵襲的に転写活性を定量するシステムを開発する。平成6年度の成果(1)RSVヴィルスのプロモータあるいはホヤアクチン遺伝子の転写調節領域の下流に連結したイオンチャネル遺伝子をもちいたホヤ胚での発現は再現性に乏しいので、原因を探るためcDNAよりmRNAを合成して発現させることにした。(2)従来,ホヤ胚でのmRNA注入による発現は困難とされていたが,thymidine kinase mRNAの5'端を連結すると高効率でβ-galactosidaseを発現することがわかった.そこで(3)同じ5'端をホヤNaチャネルに連結した結果、チャネルの発現量が安定し,ホヤ胚細胞が発現系として有用であることがわかった.(4)ホヤ神経割球で内因性Naチャネルと区別するため、アミノ酸配列を変換してTTX感受性としたNaチャネルを作成し、これより合成したmRNAを注入している。(5)Ca透過性をもつラットグルタミン酸受容体GluR1遺伝子をアクチン遺伝子の転写調節領域あるいはRSVプロモータに連結したレポータ遺伝子を作製中である。
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