老人痴呆症発症に関与する生体分子の診断用酵素免疫測定法の開発

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05557036
• 研究機関: 岐阜薬科大学
• 研究代表者: 林 恭三 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (00029935)
• 研究分担者: 永岡 明伸 武田薬品工業株式会社, 研究所長 ; 古川 美子 岐阜薬科大学, 薬学部, 助手 (20219108) ; 古川 昭栄 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教授 (90159129)
• キーワード: 老人痴呆症 / 酵素免疫側定法(EIA) / 最少検出量 / 再現性 / 特異性 / NGF / NT-3 / bFGF

研究概要

本研究は老人痴呆症に関与すると考えられる生体成分の酵素免疫測定法(EIA)を確立し、本法を用いて老人痴呆患者の早期診断法として活用することを目的したものである。その結果、(1)本年度はビオチンと抗体間にスペーサーを導入した複合体を用いて申請者らがすでに報告しているbFGFするEIA系を更に高感度化した。すなわち組換え型ヒトbFGFと抗ヒトbFGFモノクローナル抗体を材料としてまずビオチン化抗体を調整しポリスチレンビーズに試料中のbFGFを固定化後ビオチン化抗体とペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで増幅する方法に従った。確立したEIA系の感度は約1pg/ml(約0.1pg/assay tybe)と以前の系より約30倍高感度であり再現性、ヒト血清からの添加回収率も良好であった。ヒト血清中には16KDa bFGFのほか高分子量bFGFのほか高分子量bFGFの存在が認められた。(2)ヒトNT-3に対するEIA系は固相に抗NT-3ポリクローナル抗体を結合させ試料中のNT-3をビオチン標識二次抗体でサンドイッチする方法に従った。最少検出量0.5-1.0pg/ml、相同性の高い他の神経栄養因子(NTF)であるNGF,BDNFとは300ng/mlまで反応しない特異性の高い測定系で、再現性にも優れていた。(3)ヒトNGFに対するEIA系はマウスNGFの場合と同様組換え型ヒトNGFに対するポリクローナル抗体を調製した後、上記のNT-3と同様two-siteEIA系により高感度(0.3-1.0pg/ml)で再現性(変動係数2.1-8.2%)、特異性に優れた測定系で生理的NGF量を定量するには充分であった。(4)老人痴呆症のNGF,NT-レベルの変動について上記のEIA系を用いて検討した結果、脳内各部位、脳脊髄液および抹消血中のNGF、NT-3レベルに有意な差は認められなかった。今後は病態とこれらのNTFレベルの変動についても詳細に検討することを予定している。

研究成果

• [文献書誌] M.Nakajima,S.Furukawa,K.Hayashi,T.Kawashima,Y.Hayashi: "An Imoroved Solid-Phase Bioassay for Neurotrophic Fator." J.Neurochem.60. 267-273 (1993)
• [文献書誌] M.Kurobe,Y.Takei,T.Fukatsu,A.Kato,K.Hayashi: "Peroxidase-Lonked Anti-Basic Fibroblast Growth Factor Monoclonal Antibody Fab'Conjugates:Application for Two-Site Enzyme Immunoassay and Immunohistochemical Detection." Bioconjugate Chem.4. 134-138 (1993)
• [文献書誌] K.Murase,T.Nabeshima,Y.Robitaille,R.Quirion,M.Ogawa,K.Hayashi: "NGF Level is not Decreased in the Serum, Brain-Spinal Fluid,Hippocampus,or Parietal Cortex of Individuals with Alzheimer's Disease." Biochm.Biophys.Res.Commun.193. 198-203 (1993)
• [文献書誌] K.Murase,A.Hattori,M.Kohno,K.Hayashi: "Stimulation of Nerve Growth Factor Synthesis/Secretion in Mouse Astroglical Cells by Coenzymes." Biochem.Mol.Biol.Inter.30. 615-621 (1993)
• [文献書誌] S.Ogawa,T.Nabeshima,T.Kzmeyama,K.Hayashi: "Effects of Nerve Grwoth Factor(NGF)in Rats with Basal Forebrain Lesions." Japan.J.Pharmacol.61. 141-144 (1993)
• [文献書誌] A.Nitta,K.Murase,Y.Furukawa,K.Hayashi,T.Hasegawa,T.Nabeshima: "Effects of Oral Administration of a Stimulator for Nerve Growth Factor Synthesis in Basal Forebrain-Lesioned Rats." Eur.J.Pharmacol.250. 23-30 (1993)
• [文献書誌] 古川美子,林恭三: "神経内分泌免疫学-成長因子" 朝倉書店, 312 (1993)
• [文献書誌] 林恭三,古川昭栄: "タンパク質化学第8巻、成長因子I,II" 広川書店, 281 (1993)