CD14によるショック制御法開発のための基礎的研究

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05557057
• 研究機関: 大分医科大学
• 研究代表者: 樋口 安典 大分医科大学, 医学部, 助教授 (60040284)
• 研究分担者: 秋月 真一郎 大分医科大学, 医学部, 助手 (80159334)
• キーワード: CD14 / Kupffer / transgeve / recombinant

研究概要

1.ウサギCD14 cDNAの分離解析:ウサギCD14 cDNAを分離し、全塩基配列を決定した。2.リコンビナントマウスCD14(rCD14)および抗マウスCD14抗体作成:マウスのCD14の全長コードするcDNAを用いてrCD14を大腸菌ベクターに発現させ、精製した。rCD14を抗原として種々のmAbを作成した。これらを用いてPAP法やFACSでCD14が顆粒球・単球にのみ発現することを証明した。これらのmAbがin vitroでLPSによるMφ細胞株からのTNF遊離を阻止することを観察した。3.CD14遺伝子発現機序の解析:TPA responsive element様配列(TRE)のオリゴヌクレオチドを合成しこれをDNA結合ラテックスに結合させHINS-B3細胞の核蛋白をこのカラムでaffinity精製した。このカラムによりTREと結合する三種のDNA結合蛋白を観察した。4..Kupffer細胞(KC)におけるCD14の意義の検索:KCとはMφのCD14,CD18,TNFα,IL-1,IL-6のmRNA発現を検討し、KCにおけるCD14はLPSのスカベンジャーとしても機能することを明らかにした。5.CD14の活性部位検索:これまでに作成したrCD14は封入体として採取され、抗原として利用出来たが、refoldingの問題でLPS結合活性を欠如し、ショック制御実験に使用出来なかった。そこで新たにレコンビナントCD14の作成を試み、mCD14のN末端から109個および140個のペプチドを大腸菌にsoluble formとして発現HPLCさせることに成功した。さらにHPLCで大量に分離精製することに成功した。現在これを用いて抗体作成中である。また、LPS結合性のin vitroおよびin vivo実験、さらに、ショックの制御実験を計画中である。6.CD14トランスジェニックカウス(TM)樹立と解析:メタロチオネイン遺伝子5'領域をプロモーターとする天然型(膜型)とC末端短縮型(非膜型)のCD14を発現するTMの作成に成功した。両型とも通常食では肝に発現し、50mM/ml亜鉛投与TMでは両型とも小腸に強く発現した。これまでheterozygoteを用いた実験で非膜型TMでは末梢血遊離mCD14値が正常および膜型TMのそれに比べ有意に高く、また、LPS投与時のTNFα値も有意に高いことを観察した。現在さらにTMのC57BLへのback crossによる純系化とhomozygoteの樹立を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Matsuura,K: "Upregulation of mouse CD14 expression in Kupffer cells by lipopolysaccharide" Journal of Experimental Medicine. 179. 1671-1676 (1994)
• [文献書誌] Hijiya,N.: "Cloning and characterization of the human osteopontin gene and its promoter" Biochemical Journal. 303. 255-262 (1994)
• [文献書誌] Ishida,T.: "Enhancement of murine serum amyloid A3(SAA3)mRNA expression by glucocorticoids and its regulation by cytokines" Journal of Leukocyte Biology. 56. 797-806 (1994)
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Structure of the osteopontin gene and promoter" Annals of New York Academy of Science. (in press).
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Effect of recombinant osteopontin on adhesion and migration of P388D1 cells" Annals of New York Academy of Science. (in press).
• [文献書誌] Miyazaki,Y.: "Osteopontin:Role in cell signalling and adhesion" Annals of New York Academy of Science. (in press).
• [文献書誌] Nasu,K.: "Expression of wild type and mutated rabbit osteopontin in Escherichia coli,and their effects on adhesion and migration of P38D1 cells" Biochemical Journal. (in press).
• [文献書誌] 樋口安典: "CD14とエンドトキシンショック" 臨床免疫. (印刷中).
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Leukocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens" Springer Verlag(in press), (1995)
• [文献書誌] Yamamoto,S.: "Leukocyte Typing V White Cell Differentiation Antigens" Springer Verlag(in press), (1995)
• [文献書誌] 樋口安典: "現代病理学大系" 中山書店(印刷中), (1995)