高効率、高機能無細胞タンパク質合成系の開発

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05558085
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 遠藤 斗志也 名古屋大学, 理学部, 教授 (70152014)
• 研究分担者: 中井 正人 名古屋大学, 理学部, 助手 (90222158)
• キーワード: 無細胞タンパク質合成系 / 酵母 / 分子シャペロン / hsp70

研究概要

無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成を盛んに行っている細胞の細胞抽出液(サイトゾル画分)を用いて、mRNA、アミノ酸、エネルギー源としてのATPなどを加えることによりin vitroでタンパク質合成を行うもので、生細胞を用いたタンパク質合成に比べて、翻訳産物の毒性の問題を回避できる等の利点があり、非天然アミノ酸を組み込む等、タンパク質工学への新たな応用が期待されている。しかし一方で、無細胞タンパク質合成系で合成されたタンパク質の高次構造形成に関しては知見が乏しく、機能をもったタンパク質をいかに効率よく合成できるかが、今後の応用に際してのボトルネックとなる可能性があった。そこで今回、無細胞タンパク質合成系において、合成タンパク質の高次構造形成に関与すると考えられる分子シャペロンの存在量をコントロールするシステムの確立を試みた。酵母サイトゾルには分子シャペロンであるhsp70(Ssal-4p)が存在するが、このうちSsalpのみ発現するよう改変した酵母株を、さらにSsalpの代わりにC末端にヒスチジンのタグをつけたHis-Ssalpを発現するよう、改変した。この酵母株から細胞抽出液を調製し、タンパク質合成が可能であることを確認した。次にヒスチジンに対するアフイニティカラムであるニッケルカラムを用いて、細胞抽出液からHis-Ssalpを選択的に除去した。2回の連続したカラム操作により、His-Ssalpを処理前の5%程度にまで、減少させることに成功した。現在、His-Ssalpを特異的に除去した細胞抽出液中でタンパク質合成を行い、タンパク質の高次構造形成がどのように影響を受けるか検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Nakai,M.et al.: "Ygelp,a eukaryotic GrpE homolog,is localized in the mitochondrial matrix and interacts with mitochondrial hsp70." Biochem.Biophys.Res.Commun.200. 435-442 (1994)
• [文献書誌] Nakai,M.et al.: "Identification and characterization of the SecA protein homologue in the cyanobacterium Synechococcus PCC7942." Biochem.Biophys.Res.Commun.200. 844-851 (1994)
• [文献書誌] Endo,T.et al.: "Chloroplast protein import:chloroplast envelopes and thylakoids have different abilities to unfold proteins." Eur.J.Biochem.225. 403-409 (1994)
• [文献書誌] Nakai,M.et al.: "Identification of the SecA protein homolng in pea chloroplasts and its possible involvement in thylakoidal pratein transport." J.Biol.Chem.269. 31338-31341 (1994)
• [文献書誌] Nakai,M.& Endo,T.: "Identification of yeast MAS17 encoding the functional counterpart of the mitochondrial receptor complex protein MOM22 of N.C." FEBS Lett.357. 202-206 (1995)
• [文献書誌] Endo,T.et al.: "Mitochondrial presequences can induce aggregation of unfolded proteins." FEBS Lett.359. 93-96 (1995)