蛋白質大量生産のための連続式無細胞合成装置の開発

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05558087
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 遠藤 弥重太 愛媛大学, 工学部, 教授 (40093843)
• 研究分担者: 中野 功一 東ソー株式会社, 生物工学研究所, 室長 ; 横山 茂之 東京大学, 理学部, 教授 (00159229)
• キーワード: 無細胞蛋白質合成 / リボソーム / ロボソームRNA / RNA N-グリコシダーゼ / 翻訳活性の効率化

研究概要

1.反応槽・送液系:内容量100mlの密閉・逆転型反応槽の開発に着手した。このように大きい反応槽では、単位容積あたりの限外ろ過膜面積が小さくなり、目詰が問題となった。そこで、現在、10mlの反応槽10個を並列させる多槽型について、実験を進めている。
2.細胞蛋白合成系の効率化:一般に細胞抽出液における蛋白質合成活性は極めて低いので、今後の大量化戦略にはこの点についても大きな問題となる。代表者の遠藤らは、小麦胚芽抽出液には自身のリボソームを不活性化するリボソーム不活性蛋白質(RIP)が内在し、これが翻訳反応を阻害することを最近になって見い出した。そこで、抗トリチン抗体を作製し、系に添加することによって反応液中のこのRIP活性を中和し蛋白質合成の効率化を試みた。その結果、従来の系に比べて、合成速度および翻訳持続時間とも改善され、約4倍の蛋白質合成量を達成した。すなわち、1mlの反応容量当たり0.5mgのDHFRを合成することができた。この系においてもトリチン活性は充分に中和されておらず、今後この点を改良することによって、さらなる高効率化が可能であると期待できる。また、大腸菌抽出液では調製中に不可避的に混入するリボヌクレアーゼが蛋白質合成阻害因子となっているものと考えられるが、これに対しても抗体を利用した同様な方法で蛋白質合成の効率化を試みている。なお、大腸菌系では、アルミナ等を用いる従来の細胞破砕方法には蛋白質合成活性の低下防止策に限界があることが判明したので、現在新規な破砕方法の開発を進めている。

研究成果

• [文献書誌] Anton Gluck: "The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin" Nucleic Acids Res.22. 321-324 (1994)
• [文献書誌] Kikuo Ogata: "Properties and function of rat liver cytosolic 5S rRNA" Nucleic Acids Sympo.Ser.31. 271-272 (1994)
• [文献書誌] Shigeo Yoshinari: "PAPnase,a novel enzyme found inwheat germ that cleaves phosphodiester bond" Nucleic Acids Sympo.Ser.31. 209-210 (1994)
• [文献書誌] Minoru Tamura: "Synthesis of a photo-reactive cDNA probe with a sequence to recoqnize the GTPase domain of 28S rRNA" Nucleic Acids Sympo.Ser.31. 69-70 (1994)
• [文献書誌] Osamu Nureki: "Molecular recognition of the identity-determinant set of isoleucine transfer RNA from E.coli" J.Mol.Biol.236. 710-724 (1994)
• [文献書誌] Hideo Hosaka: "Sequence-specific cleavage of oligoriboncleotide capable of forming a stem and loop structure" J.Biol.Chem.269. 20090-20094 (1994)
• [文献書誌] 折田正弥: "PHARM TECH JAPAN" 機能性核酸のNMRによる構造解析, 14 (1994)
• [文献書誌] 遠藤弥重太: "遺伝" リボソームRNAの構造と機能, 5 (1994)