1994 年度実績報告書

化学発光法に基づく新しい核酸の標識法の開発-非RIによる簡便なRNAの塩基配列決定法を目指して-

研究課題

研究課題/領域番号	05558090
研究機関	東京工業大学
研究代表者	関根光雄東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40111679)
研究分担者	高橋秀臣日本ミリポリ, R&D研, 主任研究員西川一八東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (60109262)
キーワード	化学発光 / ビオチン / 標識 / RNA / 塩基配列決定法 / リン酸化 / ジホスフェート / リンカー
研究概要	初年度では3量体のレベルでRNAを3'末端ビオチン標識する新規ビオチン化法を開拓できた。そこで、本年度ではさらに3'末端ビオチン標識による化学発光法によるRNAの塩基配列の決定法への応用を3量体からオリゴマーレベルに研究を移行した。まず、ビオチンをシチジンの塩基のアミノ基に連結したシチジン3'、5'-ビスホスフェート誘導体を用いて。RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルした。この標識体をビオチン-アビジンの抗原-抗体反応を原理とする化学発光法により、塩基配列を決定した。その結果UVクロスリンク領域が3'末端付近であまりないことがわかり、3'末端から10塩基残基は解読できないことがわかった。そこで、ビオチンを3'末端のリン酸基に連結したデオキシシチジンを含むオリゴチミジレート(17量体)を合成した。これを用いて、RNAリガーゼで酵母のフェニルアラニルtRNAを3'末端ラベルしたところ、フェニルアラニルtRNAを3'末端まで明瞭に塩基配列を解読できることがわかった。さらに、酵母のフェニルアラニルtRNAを5'末端標識法も開発することが出来た。5'末端にビチオンを導入したオリゴデキシヌクレオチドを合成し、3'末端にはRNAリガーゼのよい基質になるプリン塩基をもつオリゴボヌクレオチドを連結した。このキメラオリゴヌクレオチドと酵母のフェニルアラニルtRNAをRNAリガーゼで連結させたところ、ビオチン標識されたサンプルを得ることができた。これを用いて、化学発光法により塩基配列を決定した。その結果、フェニルアラニルtRNAを5'-末端付近も明瞭に塩基配列を読み取ることができた。以上の検討で、当初の目標通りRNAの3'および5'末端標識法を確立することができた。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] M.Sekine et al.: "Simultaneous Removal of Two 2-Cyano-1,1-dimethylethyl Groups from Bis(2-Cyano-1,1-dimethylethyl)thymidine 3'-Phosphate Derivatives by the Use of DBU/BSA" Natural Products Letters. 5. 41-46 (1994)
[文献書誌] M.Sekine et al.: "New Method of Removal of Modifies Trityl and Pixyl Groups by Use of an Acid Species Generated by Reaction of Dethyl Oxamalonate with Methanol" Nucleosides&Nucleotides. 6&7. 1397-1414 (1994)
[文献書誌] T.Wada et al.: "2-Trimethylsilyl)etyl as a Phosphate Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis" Tetrahedron Letters. 35. 757-760 (1994)
[文献書誌] M.Katahira et al.: "A Raman Spectroscopic Study on Conformations of DNA Oligomers:A Dominant Effect of an AA:TT Sequence over Those of AT:AT and TA:TA Sequences" Nuclesides&Nucleotides. 6&7. 1467-1482 (1994)
[文献書誌] M.Sekine et al.: "Chemical Synthesis and Propertise of an Interresidually Cyclized Uridyly(3'-5')uridine as a model of tRNA Utum Structure Having a Sharp Bend" J.Am.Chem.Soc.116. 4469-4470 (1994)
[文献書誌] T.Wada et al.: "Synthesis and Propertise of N-Phosphorylated Nucleosides" J.Am.Chem.Soc.116. 9901-9911 (1994)

1994 年度 実績報告書

化学発光法に基づく新しい核酸の標識法の開発-非RIによる簡便なRNAの塩基配列決定法を目指して-

研究代表者

関根 光雄 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40111679)

研究成果

[文献書誌] M.Sekine et al.: "Simultaneous Removal of Two 2-Cyano-1,1-dimethylethyl Groups from Bis(2-Cyano-1,1-dimethylethyl)thymidine 3'-Phosphate Derivatives by the Use of DBU/BSA" Natural Products Letters. 5. 41-46 (1994)

[文献書誌] M.Sekine et al.: "New Method of Removal of Modifies Trityl and Pixyl Groups by Use of an Acid Species Generated by Reaction of Dethyl Oxamalonate with Methanol" Nucleosides&Nucleotides. 6&7. 1397-1414 (1994)

[文献書誌] T.Wada et al.: "2-Trimethylsilyl)etyl as a Phosphate Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis" Tetrahedron Letters. 35. 757-760 (1994)

[文献書誌] M.Katahira et al.: "A Raman Spectroscopic Study on Conformations of DNA Oligomers:A Dominant Effect of an AA:TT Sequence over Those of AT:AT and TA:TA Sequences" Nuclesides&Nucleotides. 6&7. 1467-1482 (1994)

[文献書誌] M.Sekine et al.: "Chemical Synthesis and Propertise of an Interresidually Cyclized Uridyly(3'-5')uridine as a model of tRNA Utum Structure Having a Sharp Bend" J.Am.Chem.Soc.116. 4469-4470 (1994)

[文献書誌] T.Wada et al.: "Synthesis and Propertise of N-Phosphorylated Nucleosides" J.Am.Chem.Soc.116. 9901-9911 (1994)

1994 年度実績報告書

関根光雄東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (40111679)