| 研究課題/領域番号 |
05558094
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
仙波 恵美子 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (00135691)
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| 研究分担者 |
野口 光一 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (10212127)
河合 良訓 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (80211861)
刀祢 重信 和歌山県立医科大学, 医学部, 助手 (70211399)
宮本 博行 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (90029778)
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| キーワード | Pseudorabies virus / トランスフェクション / Transneuronal tracer / neuron / 遺伝子導入 / 後根神経節 / 咬筋 |
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| 研究概要 |
昨年度に引続き、ウィルス遺伝子の外来遺伝子の組み込みを行った。まず、genomic PrVよりSphI-fragment(gX,gp50,gp63,gIなどの糖蛋白をコードする)を切取り、pFBI-Iに導入。gXのBamHI siteに、E.Coliのβ-Gal遺伝子のBamHI fragmentを接続した。β-Gal遺伝子を組み込んだプラスミドをVERO cellにトランスフェクションさせる諸条件につき検討を行った。VERO cellへのトランスフェクションの効率は、Pig kidney cellの場合の約10倍であった。しかし、トランスフェクションの効率は毎回異なり、安定した効率でトランスフェクションできる条件について更に検討中である。
更に今年度は、得られたβ-Gal-PrVをトランスニューロナルなトレーサーとして実用化し、特定の臓器や組織を支配する神経系に遺伝子導入を行うための諸条件、すなわち接種するウィルスの濃度や投与量、接種後の動物の生存期間(2日〜10日)などについて検討を加えた。接種部位として、皮膚・眼球・咬筋を選んだ。皮膚・後根神経節・感触伝導路、網膜・視覚伝導路、咬筋・三叉神経中脳路核については遺伝子発現を含め解剖学的検討の基礎データをを蓄積しているからである(研究発表の項参照)。得られたβ-Gal-PrVの量が十分出ないため、論文としてまとめるには至っていないが、投与するウィルスは1〜3×10^6pfu/mlの濃度で30〜60nlが適当であると思われる。量が多過ぎるとleakが増えnon-specificな標識の原因となるようである。生存期間は4日が最も適当であった。来年度はこれらの基礎データをもとに、神経系への外来遺伝子の導入に取り組んでいきたい。まずは皮膚に接種し、後根神経節を経て体性感覚伝導路における遺伝子発現を操作することにより、痛覚などに関連した行動の変化を明らかにすることを目指している。
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