| 研究課題/領域番号 |
05660092
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
桑原 正章 京都大学, 木質科学研究所, 教授 (40035978)
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| 研究分担者 |
渡邊 隆司 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (80201200)
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| キーワード | 担子菌 / 宿主・ベクター系 / ペルオキシダーゼ / ミトコンドリア / プラスミド / マンガンペルオキシダーゼ / Pleurotus ostreatus |
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| 研究概要 |
担子菌における宿主・ベクター系の開発において必要であるマーカー遺伝子の単離を目的として、各種のペルオキシダーゼ間で保存されているアミノ酸配列領域から推定した塩基配列を用いてPCRを行ない、その結果得られたPleurotus ostreatus(ヒラタケ)のマンガン依存性ペルオキシダーゼをコードすると考えられるDNA断片をプローブとし、サザンハイブリダイゼーションによりヒラタケゲノムライブラリーのスクリーニングを行なったところ、特異的なシグナルが多数見られた。2次スクリーニングの結果、陽性であったクローンのそれぞれについてサブクローニングを行い、その一部については塩基配列を決定した。また、これらのクローンに含まれる遺伝子のヒラタケ細胞内での発現を確かめるため、リバーストランスクリプターゼを介したPCR法(RT-PCR)により、マンガン依存性ペルオキシダーゼ活性が最高となる直前のヒラタケ菌糸体から調製したRNAを鋳型として特異的配列の増幅を試みたところ、実際にこれらの遺伝子が発現され、メッセンジャーRNAが転写されていることを確認した。
一方、ミトコンドリアのプラスミドを単離して担子菌ベクターの一部としての使用を試みるために、ヒラタケ菌糸体から2つの線状ミトコンドリアプラスミド(PO-1、PO-2)を分離精製し、クローニングを試みた。このうちPO-1については既に約55%の領域を大腸菌ベクター内にクローニングした。
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