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クマモリシンは、熊本県阿蘇地方の高熱泉より分離した好熱菌より生産される酸性プロテアーゼである。この酵素は酸性プロテアーゼとしては異常に耐熱性が高いばかりか、既知の各種プロテアーゼインヒビターに阻害を受けない、基質特異性が極めて高いなどのユニークな諸性質を持つている。本研究課題では本酵素の基質特異性の解析、蛋白及び遺伝子レベル両面からの一次構造の解明を行うことを目的に本年度は以下に示す実験結果を得た。1.基質特異性の解析:クマモリシンは酸化インスリンB鎖のLeu(15)-Tyr(16)の結合を特異的かつ高い反応速度(Km=9.0x10^<-5>M、Kcat=71S^<-1>、30℃)で水解した。そこで、このデータを基に種々の検討を加えたところ、この切断点よりC末端側へ4残基、N末端側に2残基よりなるヘキサペプチド(VEALYL)がクマモリシンの最小基質であることが明かとなった。現在、それぞれのサブサイト(P1-P4)に対応するアミノ酸残基を変えたヘキサペプチド類を多数合成し、クマモリシンとの反応を速度論的に解析している。2.クマモリシンの一次構造解析:クマモリシンをトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、サーモリシン等のプロテアーゼで限定分解し、逆相HPLCで各消化ペプチド断片を分離精製後、それらのアミノ酸配列を自動アミノ酸アナライザーにより100残基分決定した。残り300残基分については現在解析中である。一方、このアミノ酸配列データを基にクマモリシン遺伝子スクリニング用のDNAプローブを作成し、酵素遺伝子のクローニングを開始した。ハイブリダイゼーション実験を繰り返し、染色体DNAのSalI消化断片約3kbpに目的遺伝子の存在が判明し、その断片をpUC18の同部位に挿入することに成功した。現在、得られたプラスミドpK1の詳細な制限酵素地図を作成し、塩基配列の解析を行っている。
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