| 研究課題/領域番号 |
05660115
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
大久保 明 東京大学, 農学部, 助教授 (20111479)
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| 研究分担者 |
吉村 悦郎 東京大学, 農学部, 助教授 (10130303)
山崎 素直 東京大学, 農学部, 教授 (00011982)
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| キーワード | キャピラリー電気泳動 / DMSO還元酵素 / CZE / モリブデン酵素 / ミセル動電クロマトグラフィー / MEKC |
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| 研究概要 |
現有の諸設備を利用して、平成5年度と同様に脱窒光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f.s.denitroficansを嫌気的・光条件下でDMSOを添加して培養し、DMSO還元酵素を誘導合成させた。培養した菌体のペリプラズム画分より硫安沈殿、ゲル濾過、イオン交換、ヒドロキシアパタイトカラムを用いてDMSO還元酵素を抽出、精製した。精製した酵素を用い、キャピラリー電気泳動装置(現有)を利用した新規の本酵素の酵素活性測定法を開発を行った。その結果ミセル導電クロマトグラフィーの分離モードを用い、pH7の100mMほう酸バッファーと50mMのリン酸バッファーを混合しSDSを50mMになるように加えた泳動バッファー分離には最適であり、印加電圧は15KV、試料の注入方法は5cmで10秒の落差法、検出は200nmで行うことと結論した。DMSOとDMSのキャピラリー電気泳動法での定量性が、本酵素の活性測定には十分なことを確認した。酵素活性は50mM PIPESバッッファー中のDMSOのDMSへの変換を追跡することによって行った。本法は従来のベンジルビオローゲンを用いた方法と良い相関を示すことを確認した。今回確立した方法を用いてDMSO還元酵素への電子供与体の検索を試みた。French pressで細胞を破砕し、超遠心によって膜タンパク画分と水溶性画分に分けたところ、水溶性画分にDMSO dependent oxidation活性が認められた。これは菌体のペリプラズム空間に由来することを確認した。硫酸アンモニウム分画、疎水クロマト、ゲル濾過にを経て最終的にSDS-PAGEでシングルバンドになるまで精製した。得られたタンパク質は50kDaの分子量を示し、ICP発光分析によりFeを含有していること、可視部の吸収波長にcytochrome型のピークが見られないこと、EDTAによりFeを除くと活性が減少することから、Fe-Sクラスターを有するferredoxin typeのタンパクである可能性が示唆された。
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