| 研究課題/領域番号 |
05660144
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
白畑 實隆 九州大学, 農学研究科, 助教授 (90154377)
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| 研究分担者 |
立花 宏文 九州大学, 農学研究科, 助手 (70236545)
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| キーワード | 動物細胞生産性増強 / プロモーター活性化 / ガン遺伝子 / ras / CMVプロモーター / ヒトインターロイキン-6 / 遺伝子増幅 |
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| 研究概要 |
ガン遺伝子による特定のプロモーター活性化を利用して動物細胞の生産性を増強するために、myb、fos、jun、myc、E1A、c-Ha-rasなどのガン遺伝子をCMVプロモーターの下流に連結したエフェクタープラスミドを構築した。また、レポータープラスミドとしてヒトインターロイキン-6(hIL-6)のcDNAをbeta-アクチン、CMV、MTIIA、SV40、SRalphaプロモーターの下流に連結したレポータープラスミドを構築した。まず、これらのエフェクター及びレポータープラスミドをCOS-1細胞及びBHK-21細胞にコトランスフェクションし、hIL-6の生産性に及ぼすガン遺伝子の影響を調べた。その結果、rasガン遺伝子が広範なプロモーターを活性化することが示唆された。また、CMV及びSV40プロモーターが種々の動物細胞中で高いプロモーター活性を示すことが明らかとなった。
そこで、安定な高生産性細胞を得るために、CMVプロモーター制御下にhIL-6を生産する組換えBHK細胞にエフェクタープラスミドとpSV2dhfrプラスミドをコトランスフェクションし、ガン遺伝子を50nMのメトトレキセートで弱く増幅した。その結果、rasガン遺伝子を増幅した場合にのみ20倍ほど高い生産性を示す細胞が多数出現した。コトランスフェクション条件の最適化によりコントロールに比べて約35倍高い生産性を示すクローンが得られた。こうして作成された高生産性細胞は2ケ月以上安定にhIL-6を生産した。高生産性細胞中ではrasタンパク質生産が増強されていることが抗体染色法により実証された。
以上のように、rasガン遺伝子により動物細胞の組換えタンパク質生産性を著しく増強できることを明らかにした。
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