| 研究課題/領域番号 |
05660234
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
原 研治 長崎大学, 水産学部, 助教授 (10039737)
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| 研究分担者 |
橘 勝康 長崎大学, 水産学部, 助教授 (20171712)
槌本 六良 長崎大学, 水産学部, 教授 (20080525)
石原 忠 長崎大学, 水産学部, 教授 (40039722)
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| キーワード | 魚類カテプシン / プロセッシング / マクロファージ |
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| 研究概要 |
[カテプシンHポリクローナル抗体の作成]前年度精製のうまくゆかなかったカテプシンHをコイ筋肉から精製し約300μgを得た。精製したカテプシンHをラットに免疫しカテプシンHのポリクローナル抗体を得た。
[カテプシンLのモノクローナル抗体の作成]昨年、カテプシンLの抗体を産生する細胞を5クローンを分離した。本年はこの中から、カテプシンLにより特異的なクローンを選び出し、抗体を産生させた。
[カテプシンの生合成とプロセッシング]培養コイ腹腔マクロファージにアイソトープを取り込ませ、特異抗体を用い、カテプシンLの生合成とプロセッシングを検討した。その結果、カテプシンLは42kDaのプロ型酵素として合成され、ついで30kDaの一本鎖成熟酵素に変換された。また、この変換はペプスタチンAとE-64で阻害されたことにより、この変換に関わるプロセッシングプロテアーゼはカテプシンDとカテプシンL自身の自己分解によるものと考えられた。
一方カテプシンB、Hは作成した抗体との結合力が弱く、パルス-チェイス実験では明確な結果は得られなかった。しかしながら、ポリクローナル抗体を用いたイムノブロッティング法によりプロ型酵素と成熟型酵素の推定を行った。その結果、カテプシンBは42kDaのプロ型酵素として合成され、ついで、30kDaの一本鎖成熟型酵素に変換されることが推定された。また、カテプシンHは44kDaのプロ型酵素で合成され、27kDaの一本鎖型成熟型酵素に変換されることが推定された。
[今後の展開]魚類カテプシンとそのポリクローナル抗体との結合は動物(ラット)のカテプシンとその抗体との結合よりかなり弱く、今回のようなパルス-チェイス実験には大量の抗体が必要であった。今後、これらのカテプシンBとHのモノクローナル抗体を作成し、抗体を補充し、これらの酵素の生合成とプロセッシング機構を明らかにする予定である。
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