腎遠位尿細管培養細胞に対する抗利尿ホルモン作用の分子機構

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05670058
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 萩原 暢子 大阪医科大学, 医学部, 講師 (00164765)
• キーワード: patch-clamp法 / 単離尿細管細胞 / Kチャネル / イオンチャネル阻害剤 / pH感受性

研究概要

アフリカツメガエル腎遠位尿細管由来の培養細胞(A6細胞)にパッチクランプ法を用いて、抗利尿ホルモン作用の分子レベルの解析を試みた。今回はCO_2インキュベータ等の設定条件が哺乳動物と異なりA6細胞の使用が困難となったために、アフリカツメガエルと同様の両性類(食用蛙)の単離尿細管細胞を用いて実験した。この細胞を用いた実験の報告はあまりなく、当教室でも細胞条件を決定するためにかなりの時間を費やした。そのため現時点では、抗利尿ホルモン作用実験の予備段階として、単離尿細管細胞に存在するチャネルの解析を行った。実験には、コラゲナーゼ処理した食用蛙二重潅流腎から尿細管細胞を単離して用いた。電極の先端径は2mum以下でシール抵抗は50OMEGA以上のもので実験した。
1.まずwhole-cell recordingを行って、細胞膜全コンダクタンスを測定しながらイオンチャネル阻害剤を投与すると、5mMBa溶液でコンダクタンスが減少し、溶液K濃度を増すとコンダクタンスが増大した。これよりKチャネルの存在が示された。
2.次に、cell-attached patchにより3種類のチャネルが出現し、inside-out patchで電流電圧曲線を求めると、これらのチャネルがそれぞれ約250pS、70pS、20pSの単一チャネルコンダクタンスを有するKチャネルであることが分かった。
3.70pSのKチャネルは内向き整流性があり、細胞内酸性化でチャネル活性は抑制され、アルカリで活性化された。
以上の結果より、食用蛙単離尿細管細胞には、単一チャネルコンダクタンスが約250pS,70pS、20pSのKチャネルが存在し、70pSのチャネルはpH感受性を有することが分かった(第71回日本生理学会大会発表)。これらのデータを踏まえて、次の段階では抗利尿ホルモンの作用を調べる。

研究成果

• [文献書誌] MarunakaY.: "Antidiuretic hormone-responding non-selective cation channel in distal nephron epithelium(A6)." Am.J.Physiol.発表予定. (1994)
• [文献書誌] HagiwaraN.: "Antidiuretic hormone stimulates the renal epithelial sodium transport." Jpn.Physiol.43. Suppl77 (1993)
• [文献書誌] MarunakaY.: "Insulin activates an amiloride-blockable Na channel in a distal nephron cell line(A6)." Am.J.Physiol.263. F392-F400 (1992)
• [文献書誌] HagiwaraN.: "Effect of insulin and tyrosine kinase inhibitor on ion transport in the alveolar cell of the fetal lung." Biochem.Biophys.Res.Commun.187. 802-808 (1992)
• [文献書誌] HagiwaraN.: "Insulin activates an amiloride-blokable Na channel in a distal nephron cell line(A6)." Biophys.J.61. A535 (1992)
• [文献書誌] HagiwaraN.: "Effects of dopamine on the transport of Na,H,and Ca in the bullfrog proximal tubule." Jpn.J.Physiol.40. 351-368 (1990)
• [文献書誌] 窪田隆裕: "膜学実験シリーズ第1巻 生体膜編(イオン選択性電極法)." 共立出版,東京, 424 (1994)
• [文献書誌] 窪田隆裕: "別冊・医学のあゆみ腎疾患(尿細管と電解質輸送機構)" 医歯薬出版、東京, 366 (1992)