ボツリヌス毒素の構造と機能の分子生物学的解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05670256
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 小熊 恵二 岡山大学, 医学部, 教授 (00002262)
• キーワード: ボツリヌス菌 / ボツリヌス毒素 / 毒素遺伝子 / 神経伝達物質 / 赤血球凝集素 / C_3酵素

研究概要

ボツリヌスC_1型神経毒素およびこの毒素に結合している無毒成分(Nontoxic-nonHAとHAと命名)の構造と機能を解析した。まず精製C_1毒素をジギトニン処理したPC12細胞に作用させ、この細胞からのCa^<++>誘発によるノルエピネフリン放出の抑制効果を観察した。C_1毒素は、この反応系にZn^<++>を添加すると、ノルエピネフリンの放出を阻害することが判明した。毒素によるこの阻害作用は2種類のモノクローナル抗体で中和された。この2種類のモノクローナル抗体は、毒素の軽鎖に存在するZn^<++>結合モチーフの近傍に反応することが確かめられたので、Zn^<++>結合モチーフが毒素の活性部位であることが強く示唆された。さらに毒素がZn^<++>依存性プロテアーゼ活性を示すことを確かめるため、各種の蛋白質と反応させたところ、サブスタンスPを切断することが判明した。毒素はZn^<++>存在下でのみサブスタンスPのGlu6-Phe7、Phe7-Phe8、Phe8-Gly9、Gly9-Leu10の4ケ所でそれぞれ4:2:1:1の割合で切断した。以上の事より、C_1毒素はZn^<++>存在下で、特にGlu6-Phe7の結合を切断し、これにより神経伝達物質の放出を抑制し、毒性を発揮することが示唆された。無毒成分に関しては、既にHAが53K、33K、23K、17Kのサブコンポーネントよりなることを発見し、33K蛋白の全アミノ酸配列を決定していたが、今回、53、23、17Kの構造遺伝子をクローン化し、全塩基配列を決定した。33K遺伝子の下流に17Kおよび53K+23Kの遺伝子が存在していた。従って、53Kと23Kの遺伝子は1つの構造遺伝子より翻訳され、その後に二分されることが判明した。さらに、E型毒素の無毒成分(Nontoxic-nonHA)の遺伝子もクローン化し、全配列を決定した。また、C_3酵素の構造と機能も解析し、アミノ酸配列の異なりにより、ADPリボシル化作用に差が生じる事を発見した。

研究成果

• [文献書誌] Nobuhiro Fujii: "The complete nucleotide sequence of the gene encoding the nontoxic component of Clostridium botulinum type E progenitor toxin" Journal of General Microbiology. 139. 79-86 (1993)
• [文献書誌] Nobuhiro Fujii: "Similarity in nucleotide sequence of the gene encoding nontoxic component of botulinum toxin produced by toxigenic Clostridium butyricum strain BL6340 and Clostridium botulinum type E strain Mashike" Microbiology and Immunology. 37. 395-398 (1993)
• [文献書誌] Kohji Moriishi: "Two different types of ADP-ribosyltransferase C3 from Clostridium botulinum type D lysogenized organisms" Infection and Immunity. 61. 5309-5314 (1993)
• [文献書誌] Noriko Yokosawa: "Exogenous zinc ion is required for inhibitory activity of botulinum neurotoxin C1 against norepinephrine release and its endopeptidase activity toward substance P" Biochemistry and Molecular Biology International. (in press). (1994)
• [文献書誌] 藤永由佳子: "ボツリヌスC型神経毒素に結合するHA蛋白質の遺伝子解析" 日本細菌学雑誌. 49. 155 (1994)
• [文献書誌] 友近健一: "ボツリヌスC型毒素HA成分の蛋白性状について" 日本細菌学雑誌. 49. 241 (1994)