| 研究概要 |
研究の目的は、インフルエンザウイルスが潜伏感染していると考えられるMDCK細胞のvariant(MDCK-L)細胞内のウイルスに特異的なゲノムを正確に定量し、細胞継代に伴うこれらのゲノムの動向を明らかにすると共に、潜伏感染細胞でのインフルエンザウイルスの機能発現様式を検討することである。インフルエンザウイルスの8種類のゲノムのうち、NS、M、及び、NPをベクター(Bluescript)にクローニングし、各々に制限酵素で切断できる部位を構築した。各々のベクターからインターナルコントロール(IC)としてのマイナス鎖のRNAを合成した。各々のゲノムについて既知量のICをMDBK-R細胞の破砕時に投与し、常法で総核酸を抽出した後、ICとウイルスゲノムを含む総核酸をRT-PCRに供した。制限酵素で処理したPCR産物をアガロース電気泳動で分離すると、切断されたICとウイルスゲノムのPCR産物を区別して定量することができた。両者の量比を求めることにより、既知量のICから細胞に存在するウイルスゲノムRNAを定量することができた。この方法により、以下のことが明らかになった。(1)8代継代したMDCK-L細胞内に8種類すべてのウイルスに特異的なゲノムを検出した。(2)M,NSについては、cRNAもmRNAも検出された。(3)8代継代したMDCK-L細胞内には、各々0.5〜0.8コピーのゲノムが存在しており、18代継代した同細胞内には0.1〜0.3コピーのゲノムが存在していた。ゲノムは細胞の継代にともなって徐々に減少しているが、継代数を考慮すると、ほとんど減少していないと考えられる。また、10代にわたる継代に伴ってRNAが分解されないことは考えにくいので、この細胞ではウイルスのゲノムが増殖しながら持続していることが示唆される。(4)25代継代細胞におけるNS遺伝子(PCR産物)の中から5つをクローニングして配列を決定したところ、いずれも6〜11ヶ所において変異が認められた。これらがPCRに伴う人為的変異か否かは検討中であるが、何れのクローンもA/WSNのRNA配列と異なることから、インフルエンザのゲノムはヘテロで存在している可能性を示唆していると考えられる。
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