| 研究概要 |
市原らの方法に従いラット初代培養肝細胞を作製した。24時間培養後、培地を交換し、各種濃度のIL-1(1、10、100U/ml、IL-6(10、50、100U/ml)、TNFα(1、10、100,ng/ml)、を含む培地で培養した。各種サイトカイン添加後以下の点について経時的に定量した。
(1)肝細胞中Mn-SODをELISA法による測定サイトカイン添加48時間後、肝細胞中Mn-SODをELISA法により測定した。いずれのサイトカインも濃度依存性にMn-SODの産生を増加させた(IL-1:basal levelの2倍、IL-6:basal levelの3倍、TNF:basal levelの2倍)。
(2)ノーザンブロッティングによる肝細胞中Mn-SODmRNA発現サイトカイン添加24時間後、肝細胞のRNAを抽出後、アイソトープラベルしたMn-SODのcDNAをプローブとしノーザンブロッティングMn-SODmRNAの変化を調べた。Mn-SOD蛋白の結果と同様にいずれのサイトカインもMn-SODmRNAを増加させた。なかでもIL-6が最も著しかった(basal levelの3倍)。一方、Cu,Zn-SODはmRNAレベルで全く変化なかった。
(3)アクチノマイシンDとシクロヘキシミドによる影響炎症性サイトカインによるMn-SODmRNAの増加は転写レベルかそれとも転写後の調整を受けているかアクチノマイシンDとシクロヘキシミドを用い調べた。いずれのサイトカインによる刺激でもアクチノマイシンDの影響を受けず、シクロヘキシミドによりMn-SODmRNAの発現はbasal levelに戻った。この結果から炎症性サイトカインによる初代培養肝細胞中Mn-SODの発現増加は転写レベルで調節されていると考えられた。
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