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1.実験材料と方法
前金沢大学医学部皮膚科谷口助教授より供与されたETA遺伝子を含むプラスミドpUC18を使いE.Coli TBl株を形質転換しET産生クローンを作成した。このクーンより浸透圧ショック法にてETを回収、FPLCにてrecombinant‐ET精製を試みたが、回収量は実験に供するに充分でなかった。
そこで前慈恵会医科大学細菌学教室近藤教授より供与されたS.aureus ZM株を用い硫安塩析とイオン交換クロマトグラフィーと電気泳動法によりETAを精製しこれを主に使用した。
得られたETAをエンザイモビーズ法により〓〓Iで標識した。つぎに培養ヒトケラチノサイトより膜蛋白をCaとbetaメルカプトエタノールの存在下でSDSにより抽出、これを塩質として標識ETAを用いてイムノブロットを施行した。
2.結果
標識ETAは表皮抽出蛋白の内、多くのケラチン蛋白とは非特異的に反応した。
一方分子量160kd付近の蛋白と反応をみとめたが、結果は一定していなかった。この反応蛋白のcharacterizationを行うため、種々のデスモゾーム構成蛋白に対する抗体で検討したがいずれにも反応しなかった。そこでこの反応するバンドを取り出し家兎に免疫し、現在抗体を作成中である。抗体作成後は組織化学的、免疫電顕的に反応部位の局在を検討さらにこの反応物質の特定を施行する予定である。また同時にイムノブロットにおける反応の非特異性の原因を検討するために、表皮膜蛋白質の抽出法を再度検討中である。さらにWisconshin医科大学LA.Diaz教授よりデスモゾーム構成蛋白の内reconbinant‐desmoglein1の供与をうけ、ETAとの反応性を検討中であることを追加する。
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