| 研究概要 |
ヒトLDL receptor遺伝子(pLDLR-2)のtransfection
(1)Trabsfection
Electronporation法を用いてTransfectionを施行した。使用機器はGENE-PULSER(Bio-Rad社)を使用,ヒトLDL receptor geneのcDNAを持ったPlasmid(pLDLR-2)を0.16μg/mlに調整,選択用PlasmidとしてPVS2-neoを用いた。選択用ネオマイシンとしてG418を用いた。
(2)導入細胞のSelection
1)Transient colonyでの検討
a.Binding assay
Transfection後1週のHepG2を用い,ヒトLDLに対するBinding assayを検討,HepG2WildとHepG2LDLRはそれぞれkd=13.4と5.6μg/ml,Bmax=0.21と0.42μg/mg cell protein示し,HepG2LDLRが親和性および結合能いずれも明らかに高値を示した。
b.Western blotting
HepG2pLDLRの膜蛋白をSDS-PAGE(3-12%)を施行後,ニトロセルロース膜に転写し,一次抗体として抗ヒトモノクロナールLDL抗体,二次抗体としてProtein Aを用いて130kDの位置に単一のバンドを認めた。いずれの結果も10日以降消失した。
c.Stable colony
Stable colonyを得るため前年度報告のCHO細胞と同様に検討したが,現時点ではStable colonyを得ていない。
(3)今後の検討
HepG2細胞を用いてCHOと同様の実験を施行,TransientのTransfectionに成功した。しかし,Stable colonyを得るには至っていない。今後,肝細胞に発現しやすいPromotorに組み込んだPlasmidを用いて検討を行なう予定である。
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