血小板は止血機構の主役を演じ、生態防御反応の一担を担う血液細胞であるが、一方、病的動脈血栓形成にも重要な役割を演じていることが知られている。血小板が機能を発揮する際には血小板膜受容体が重要であり、これら受容体蛋白の分子レベルでの解析は生理的および病的血栓の理解に必要不可欠なものとなっている。なかでも血小板膜糖蛋白Ib-IX複合体は血漿中の高分子粘着蛋白であるvon Willebrand因子(vWF)の活性化非依存性の受容体であり、血小板活性化の初期段階を制御する分子として重要である。我々はバイオテクノロジーを用いてこの受容体蛋白の一部を培養動物細胞に発現することに成功し、分泌されたこの可溶性蛋白がin vitroでvWFと血小板の反応を特異的に抑制することをつきとめた。本研究は、GPIb-IXのドメイン特異的発現を通じて活性部位の決定を行ない、あわせて抗血栓作用をもちうる最小単位の同定と機能におよぼすアミノ酸変異や蛋白の翻訳後修飾の影響について検討することを目的としている。 昨年度はすでに作成されたリコンビナントGPIb-IX受容体をコードするDNAを鋳型として、これがリガンドの理想的な競合抑制物質となるよう分子を改良した。現在までの結果によればこれらの蛋白は予想通り抗GPIα抗体と反応し、glycosylationも正しく受けていることが示唆されている。 本年度は、受容体機能におよぼす翻訳後修飾の影響を検討した。合成ペプチドや大腸菌フラグメントを用いた過去の研究成績より、蛋白の化学修飾が受容体機能に影響することが推定されているが、なかでもsulfationは重要である。すなわちsulfationをブロックする培養条件でリコンビナント蛋白を作成するとリガンドの結合が減少する事実を我々は最近つきとめており今回の実験ではどのアミノ酸がsulfationを受けているかを決定することを目的とした。これまで3つのチロシン残基に注目し、mutagenesis手法によってそれぞれフェニルアラニンに置換したリコンビナント蛋白を作成することに成功した。またこれら変異蛋白はその機能が障害されていることをつきとめた。今後、^<35>S-sulferを用いてどのアミノ酸がsulfationを受けているかを決定したい。
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