| 研究概要 |
プラスチックシャーレ上では、1alpha,25(OH)_2D_3を添加しても骨吸収能を有する破骨細胞が形成されないが、石灰化骨基質からのEDTA抽出液を1alpha,25(OH)_2D_3と同時添加することにより、骨吸収能を有する成熟破骨細胞が形成されてきた。このbioassay系を用い、石灰化骨基質に存在する成熟破骨細胞誘導因子の分離精製を試みた。
1、ウシ大腿皮骨骨骨粉1kgからEDTA脱灰処理により総蛋白量0.1gが抽出された。この抽出液と1alpha,25(OH)_2D_3(10^<-8>M)添加による骨吸収窩が形成さ、この抽出液中に骨吸収能を有する成熟破骨細胞へ分化させる誘導因子が存在することが示唆された。
2、まず始めに、Superdex 75 prep gradeによるゲル濾過により、抽出画分から成熟破骨細胞分化誘導因子を分画した。その結果、分子量約11,000前後に1つの活性ピーク画分が認められた。
3、次に、この活性画分をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用い分画したところ3つの活性画分が認められた。
4、これらの3つの活性画分MonoQ陰イオン交換、MonoS陽イオン交換を用い順次精製を試み、SDS-PAGE電気泳動後の銀染色により、2つの活性画分はそれぞれ約11,000前後に単一バンドとして確認された。
しかしながら、骨粉1kgから精製されてきた活性画分の収量が少なかったため、アミノ酸配列を検討するまで至らなかった。そこで、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、MonoQ陰イオン交換ならびにMonoS陽イオン交換による溶出条件を再検討した後、アミノ酸配列決定のための十分な試料を得るために、現在骨粉10kgから抽出精製を開始している。
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