| 研究概要 |
向流クロマトグラフィーによって,生体高分子物質,ヒト血清リポ蛋白質ならびに一本鎖DNA結合蛋白質(SSB)の分離・精製を検討した。現在,交軸型向流クロマトグラフ装置は米国NIHでしか製造されておらず,日本では入手できない。したがって,大岳製作所に依頼して試作した。
最初に,リポ蛋白質の分離のため,ポリエチレングリコール(PEG)/リン酸カリウム緩衝液(KPi)の水性二相系(APTP)のPEGの分子量や系のpH等を変化させてリポ蛋白質,血清蛋白質の分配係数を測定し,最適なAPTP系を検討した。その結果,16%PEG1000/12.5%KPi(pH9.4)の系においてリポ蛋白質,血清蛋白質の分配係数に差が認められた。そこで,この系の上層を向流クロマトグラフのカラム(容量:340ml)に充填し,500rpmで回転させつつ,ヒト血清4mlを注入し,下層で溶離した(流速:2ml/min)。2-3時間でHDL-LDL画分が完全に溶出し,ついで移動相を上層に変えることにより,VLDLを血清蛋白質と共に回収できた。従来数十時間の遠心時間を要していたリポ蛋白質画分を3時間以内に得られたので向流クロマトグラフィーの長所が十分に生かせることができた実験であった。
次に,SSBの分離に関しては,大腸菌にSSBを大量発現させた後,ホモジネートを直接カラムに導入し,SSBを精製することを目的とした。16%PEG1000/17%硫酸アンモニウムの系の下層を固定相,上層を移動相に用いるとSSBはfraction51-53に溶出され,他の多くの蛋白質から分離された。リポ蛋白質の分離に関しては投稿準備中である。
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