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本研究では、液胞型ATPaseが細胞の増殖調節、あるいは形質転換やがん化形質の獲得においていかなる役割を果たしているのかを解明するとともに、その生理作用を明らかにすることを目指し研究を行い、以下の成果を得た。
1 BPV-E5のクローニングとラット繊維芽細胞株の形質転換
ウシパピローマウイルス(BPV)のゲノムDNAからPCRによりE5遺伝子を増幅し、SV40プロモーター支配下に動物細胞発現ベクターに組み込んだ。このプラスミドをラット繊維芽細胞継代株EL2に導入し、安定形質転換株を分離した。この形質転換株は、予想されるように、他のがん遺伝子でトランスフォームした場合と同様の形態変化を示し、増殖活性の上昇が認められた。また、この株では、PDGFの添加に応答してトランスフォーメーションが促進された。一方、EL2株にE5、プロテオリピッド及びPDGF-Rを様々な組み合わせで導入したところ、3者を同時に導入した時にトランスフォーメーションが強く誘導されることを見い出した。またトランスフォーメーションにともないリソソーム内のpHが上昇することを確認した。今後、本研究で樹立した形質転換株を用いて、プロテオリピッドおよびPDGF-Rを介したE5によるトランスフォーメーションの機構を明らかにしていく。
3.マウス液胞型ATPaseプロテオリピッドサブユニット遺伝子のクローニングと遺伝子構造の解析
マスウゲノムライブラリーをスクリーニングし、プロテオリピッド遺伝子をコードするクローンを分解した。一次構造の解析から、3つのエクソンよりなるプロテオリピッド遺伝子の全構造を明らかにした。同時に、2つの偽遺伝子を見い出しその構造を決定した。一方、ノーザン解析の結果、プロテオリピッド遺伝子が未分化ES細胞で発現していることを確認した。これらの知見をもとにターゲッティングベクターを作成し、ES細胞に導入した。現在、相同組換体を選別している。今後、相同組換えにより遺伝子を破壊したES細胞を初期胚に導入しキメラマスを作成し、最終的にホモノックアウトマウスを分離する。
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