ビタミンK依存性凝固因子のプロセシングプロテアーゼの構造と機能解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05680527
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• 研究分担者: 牟田 達史 九州大学, 理学部, 助手 (60222337) ; 中川 和憲 九州大学, 医学部, 助手 (50217668)
• キーワード: ビタミンK依存性凝固因子 / プロセシングプロテアーゼ / メタルプロテアーゼ / エンドペプチターゼ 24-15

研究概要

本研究では、ビタミンK依存性凝固因子のプロセシング機構を解明することを目的とし、メタルエンドペプチダーゼ(MEP)の全一次構造をそのcDNAをクローン化することによって決定した。MEPのcDNAには、3つの開始メチオニンの候補が存在するが、MEPのアミノ末端配列が不明であるため、真の開始メチオニンは特定できなかった。最も小さい読み枠でもその分子量は80、0688と計算され、SDS-PAGEで推定された値(70、000)よりも大きく、翻訳後にアミノ末端あるいは、カルボキシ末端領域で切断を受けることが考えられた。MEPには分泌タンパク質に見られるアミノ末端のシグナクル配列がなく、ハイドロパシープロットからも全体的に親水的で、膜結合や膜貫通ドメインは存在せず、その細胞内局存性を明らかにする必要があった。Genbank を用いてホモロジー検索を行なったところ、有意な相同性を示すタンパク質が見いだされた。なかでもラットtestesメタルエンドペプチターゼ24.15は、MEPと60%という非常に高い相同性を示した。この酵素は、脳、脳下垂体,testesに多く発現しており、ネオエンドルフィン、ダイノルフィンなどからエンケファリンを生成させる際に働くペプチダーセである。一方、MEPはダイノルフィンに対しては反応しないが、その高い相同性から両者の関連性に興味が持たれ、現在、詳しいMEPの酵素特異性を各種のペプチドホルモンを用いて調べている。さらに、MEPのアミノ末端領域約33、000に相当するcDNAをPCRで増幅し、そのヌクレオチド配列を確認後、発現ベクターに組み込み大腸菌で発現させた。その結果、2Lの培養系で約300-500mu gのタンパク質が得られた。この組み替えタンパク質を抗原として、ニワトリを用いて抗体を作成し、MEPの組織特異的発現を調べた。その結果、MEPは、肝臓、賢臓、肺、胃、脳などに多く発現しており、特に表皮細胞に局在していることが判明した。現在、インムノゴールドを用いた電子顕微鏡により、MEPの細胞内局在性を解析中である。

研究成果

• [文献書誌] Kawabata,S.: "A microsomal endopeptidase from liver with substrare specificity for processing proproteins such as the vitamin K-dependent proteins of plasma." The Journal of Biological Chemistry. 267. 10331-10336 (1992)
• [文献書誌] Kawabata,S.: "Rabbit liver microsomal endopeptidase with substrate specificety for processing proproteins is structurally related to rat testes metalloendopeptidase 24.15." The Journal of Biological Chemistry. 268. 12498-12503 (1993)
• [文献書誌] Ikura,T.: "Secondary Structural Features of Modules M2 and M3 of Barnase in Solution by NMR Experiment and Distance Geometry Calculation." Proteins. 16. 341-356 (1993)
• [文献書誌] Sakumi,K.: "Cloning Expression of cDNA for a Human Enzyme That Hydrolyzes 8-Oxo-dGTP, a Mutagenic Substrate for DNA Synthesis." The Journal of Biological Chemistry. 268. 23524-23530 (1993)
• [文献書誌] Miura,Y.: "A Limulus Intracelluar Coagulation Inhibitor with Characteristics of the Serpin Superfamily, Purification,Characterization,and cDNA Cloning." The Journal of Biological Chemistry. 269. 542-547 (1994)