ヒト組織因子の立体構造の解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05680539
• 研究機関: 国立循環器病センター
• 研究代表者: 宮田 敏行 国立循環器病センター研究所, 脈管生理部, 室長 (90183970)
• 研究分担者: 小林 祐次 大坂大学, 蛋白質研究所, 助教授 (20127228)
• キーワード: 血液凝固 / 組織因子 / NMR / 立体構造 / ドメイン

研究概要

NMR法を用いて、ヒト組織因子の細胞外ドメインを構成する2つのサブドメインの立体構造を解析する目的で、組み換えDNAの手法を用いてサブドメイン間に凝固第Xa因子の認識配列を挿入し、変異細胞外ドメインを酵母を用いて発現させた。培養上清から3種のイオン交換カラムを用いて変異細胞外ドメインを単離した。この過程で、サブドメイン間に切断が生じ、最終標品として2つのサブドメインが単離できた。このサブドメインの分子量はSDSポリアクリルアミド電気泳動により16kDaと24kDaを示した。アミノ酸配列分析の結果、16kDaはNH_2末端由来のサブドメイン(N-ドメイン)であり、24kDaはCOOH末端由来のサブドメイン(C-ドメイン)であった。また、両ドメイン間の切断は、導入した凝固第Xa因子認識配列で生じていた。組織因子由来のサブドメインが、凝固第VIIa因子の合成基質水解活性に対する組織因子の増強効果を保持しているかどうかを調べたところ、N-ドメインには活性を検出できなかったが、C-ドメインは約3%の活性を保持していた。また、両ドメインを等モル混合すると約60%の活性が回復した。したがって、組織因子活性には両ドメインが必要であることが判明した。また、単離した各ドメインは失活していないことが判明したため、本ドメインをNMR測定の試料として使用し、その立体構造を明らかにできる道がひらけた。
一方、組織因子細胞外ドメインが大量に調製できたので、第VIIa因子との複合体の結晶化を各種条件下で検討している。

研究成果

• [文献書誌] T.Miyata,et al.: "Three missense mutations in the protein C heavy chain causing type I and type II protein C deficiency." Thromb,Haemost. 71. 32-37 (1994)
• [文献書誌] S.Kamei,et al.: "Amino acid sequence and inhibitory activity of Rhesus monkey tissue factor pathway inhibitor (TFPI):Comparison with human TFPI," J.Biochem.115. 708-714 (1994)
• [文献書誌] T.Miyata,et al.: "Factor IX Bm Kiryu:A Val-313-to-Asp substitution in the catalytic domain results in loss of function due to a conformational change of …" Br,J,Haematol. 88. 156-165 (1994)
• [文献書誌] Y.Z.Zheng,et al.: "Six missense mutations associated with type I and type II Protein C deficiency and implications obtained from molecular modeling." Blood Coagul.Fibrinolysis. 5. 687-696 (1994)
• [文献書誌] K.Hayashi,et al.: "Inhibition of serine proteases of the blood coagulation system by squash family protease inhibitors." J.Biochem.116. 1013-1018 (1994)
• [文献書誌] T.Miyata,et al.: "Chemical cross-linking of activated coagulation factor VII with soluble tissue factor." J.Biochem.117(印刷中). (1995)
• [文献書誌] 宮田敏行: "「ビタミンK(医学・生物学領域における新展開)」1.先天性のビタミンK依存性蛋白質の欠乏症、2)プロトロンビン欠乏症および異常症" メディカル ジャーナル社, 13 (1994)
• [文献書誌] 宮田敏行: "「血液病学、第2版」IV.止血と血栓(凝固と線溶)、D.血液凝固因子の産生・構造・機能、3.ビタミンK依存性凝固因子" 文光堂, 11 (1994)