超耐熱性α-アミラーゼの熱失活における可逆的及び不可逆的過程の分別解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05680547
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 山形 秀夫 名古屋大学, 農学部, 助教授 (20023468)
• 研究分担者: 月向 邦彦 名古屋大学, 農学部, 助教授 (10023467)
• キーワード: α-アミラーゼ / 耐熱性 / アミノ酸置換 / 部位特異的変異誘起

研究概要

Bacillus amyloliquefaciensのα-アミラーゼ(BAA、低耐熱性)とB.licheniformisのα-アミラーゼ(BLA、超耐熱、耐アルカリ性)を材料とし、不可逆的熱失活過程に影響を与えるアミノ酸配列(N末端から176〜178番目、BAAではArg-Gly-Glu、BLAでは欠失-欠失-Gln)について引き続き部位特異的変異誘起法によるアミノ酸置換を行った。Arg-Glyを欠失しGluを残した改変BAAを作製し、その熱安定性解析を行った結果、176及び177番目の残基の欠失が不可逆的熱失活の速度を顕著に遅くするという以前の推論が正しいことを確認した。また可逆的熱失活過程に影響を与えるアミノ酸配列(266から269番目、BAAではAsn-Ala-Gly-Lys、BLAではAsp-Leu-Gly-Ala)についてアミノ酸置換による解析を続行した。この部位の配列のみが完全にBLA型となった改変BAAを新たに作製して解析し、以前の解析とあわせた結果、266番目のAsnのAspへの、また269番目のLysのAlaへの置換の影響が主要であり、267番目のAlaのLeuへの置換の影響は小さいことがわかった。
一方、Bacillus brevisを宿主とする異種タンパク質の分泌生産系を一層改良し、上記の改変α-アミラーゼを大量に生産した。これを用いて熱失活過程について円二色性等の物理化学的測定を行った。しかし測定に必要な高い濃度においては、改変α-アミラーゼの凝集が観察され、意味のあるデータは得られなかった。BLAは超耐熱性であるとともに耐アルカリ性でもあるので、凝集の起こらないアルカリ性溶液中での熱失活過程について解析を行いつつある。

研究成果

• [文献書誌] Shigezo Udaka: "Protein secretion in Bacillus brevis." Journal of microbiology. (in press). (1994)
• [文献書誌] 月向 邦彦: "タンパク質の構造に及ぼす圧力の影響" 遺伝. 48. 21-25 (1994)
• [文献書誌] Shigezo Udaka: "High level secretion of heterologous proteins by Bacillus brevis" methods in Enzymology. 217. 23-34 (1993)
• [文献書誌] Yuko Ichikawa: "Very efficient extracellular production of cholera toxin B subunit using Bacillus brevis." FEMS microbiology Letters. 111. 219-224 (1993)
• [文献書誌] Kunihiko Gekko: "Effects of point mutation in a flexible loop on the stability and enzymatic function of Escherichia coli dihydrofolate reductase" Journal of Biochemistry. 113. 74-80 (1993)
• [文献書誌] 児玉 美智子: "ジヒドロ葉酸還元酵素の熱構造転移と安定性に及ぼすアミノ酸置換の影響" 日本化学会誌. no.1. 22-27 (1993)
• [文献書誌] Hideo Yamagata: "Starch processing enzymes produced by recombinant Bacteria.In Recombinant microbes for industrial and agricultural applications" Marcel Dekker,Inc., 15 (1994)
• [文献書誌] 月向 邦彦: "タンパク質の圧縮率と構造・機能.生物と食品の生物科学" さんえい出版, 11 (1993)