チトクロムP-450XVIIA1の大量生産とその膜再構成系における反応機構の解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05680554
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 小南 思郎 広島大学, 総合科学部, 教授 (10106776)
• 研究分担者: 榊 利之 住友製薬総合研究所, 主任研究員 ; 山崎 岳 広島大学, 総合科学部, 助手 (30192397)
• キーワード: 遺伝子発現 / P450XVIIA1 / 膜タンパク質 / PCR変異導入法 / 大腸菌 / ステロイド代謝 / 反応迅速停止法 / 連続的水酸化反応

研究概要

大腸菌で真核生物の膜タンパク質を発現させるためには5′末端の塩基配列を大腸菌の使用コドンに変化する必要がある。塩基配列変異プライマーを用いて、PCR法で5′末端の0.3k塩基対の変異断片を作成した。この5′末端変異断片と無変異3′末端1,5K塩基対をつないで大腸菌の発現ベクターに組み込んだ。用いたベクターはpKSN2とpCWで、両者ともtacプロモーターを持っておりIPTGの添加により発現を誘道できる。これら2つの発現プラスミッドpKSN17modとpCW17modを大腸菌JM109に形質転換して発現条件を探した。発現量は、ウエスタンブロティングとヂチオナイト還元CO差スペクトルを用いて定量した。pKSN17modの場合、大腸菌全タンパク質の数%がP450XVIIA1になるほど良く発現したが、ほとんどのタンパク質がヘム鉄を含んでいないアポ酵素であった。pCW17modの場合、タンパク質としての発現量はpKSN17modの約1/5であるその半分がホロ酵素であり、培養液1リットル当り60nmolのホロ酵素が発現した。このpCW17modにより発現した酵素はプロゲステロンに対する17α水酸化活性を持っていることも確認している。
大腸菌で発現されたP450XVIIA1をリポソーム膜に組み込むには至らなかったが、モルモット副腎から精製したP450XVIIA1を人工膜リポソームに組み込み、その反応機構を反応迅速停止法を用いて研究した。P450XVIIA1の触媒するプロゲステロンからアンドロステンヂオンへの変換は17α水酸化プロゲステロンを中間体とする連続的水酸化反応であることが反応速度論的に証明できた。

研究成果

• [文献書誌] H.D.Colby: "Adrenal activation of carbon tetrachloride:Role of micro-somal P450 Isozymes" Toxicology. (in press). (1995)
• [文献書誌] D.Xu: "Inhibition of adrenal cytochrome P450 by 1-aminobenzotiazole in vivo:Selectivity for xenobiotic metabolism" Biochemical Pharmacology. (in press). (1995)
• [文献書誌] S.Kominami: "Regulation mechanism of the catalytic activity of bovine adrenal cytochrome P450(11β)" Biochim.Biophys.Acta. 1192. 234-240 (1994)
• [文献書誌] T.Sakaki: "Kinetic studies on a genetically engineered fused enzyme between rat cytochrome P4501A1 and yeast NADPH-P450 reductase" Biochemistry. 33. 4933-4939 (1994)
• [文献書誌] T.Tamura: "Immunohistochemical Iocalization of 17-alpha-hydroxylase/C17-C20 Iyase and atomatase cytochrome P-450 in polycystic human ovaries" J.Endocrinology. 139. 503-509 (1993)
• [文献書誌] S.Kominami: "Cytochrome P-450 transfer from adrenocortical submitochondrial particles to liposome membranes" Biochemistry. (in press). (1995)
• [文献書誌] S.Kominami: "Membrane topology of bovine adrenocortical cytochrome P450(C21) Structural studies by trypsin digestion in vesicle membranes" Biochemistry. 32. 12935-12940 (1993)
• [文献書誌] S.Kominami: "Substrate binding and the reduction of cytochrome P-450" in Cytochrome P-450 Kohbansha LTD.(Tokyo)-Academic Press (New York). Chapter 4. 64-80 (1993)