バクテリオロドプシン光反応中間体の動的構造解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05680579
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 片岡 幹雄 大阪大学, 理学部, 助教授 (30150254)
• 研究分担者: 徳永 史生 大阪大学, 理学部, 教授 (80025452)
• キーワード: バクテリオロドプシン / 光反応中間体 / 時分割X線回折 / 遺伝子操作 / 点突然変異体

研究概要

バクテリオロドプシン(bR)の光反応中間体の構造を明らかにするために、D85N、D96N、D96N/D212Nの各変異bRについて性質を調べ、低温分光測定、X線回折測定を行った。どの変異bRも結晶構造には変化が見られなかった。
D96N、D96N/D212N変異bRは野生型bRと同様の光反応サイクルを持つが、野生型bRでM中間体のみが観測される-77℃ではL中間体が混在していることがわかった。M中間体の崩壊過程を時分割X線回折実験により構造学的に追跡し、その結果と分光学的測定とを比較した。pH9においては、速度定数は分光学的にも、構造学的にも同一の値が得られ、シッフ塩基の再プロトン化と構造の戻りは同時に起きていることが示唆された。一方、pH10以上では、X線回折により求めた速度定数は、分光学的に求めた値の1/3から1/5程に小さくなっており、シッフ塩基の再プロトン化が構造の戻りよりもかなり早く起きることが示された。また、pH10以上では、M中間体への回折像の変化が野生型のものと異なっている。これらの原因を明らかにすることが今後の重要な課題である。
D85Nは単一ピークのCDスペクトルを与え、レチナールの存在状態が野生型とは異なることが示された。また、D85Nは外部pHの影響を受け易く、吸収極大波長の異なる3種類の状態をとることが判明した。pH9以上では、M中間体様の吸収スペクトルを示すが、X線回折によりこの状態の構造は野生型のM中間体と同一であることが明かとなった。さらに、中性pH状態のD85Nの低温分光測定よりこの変異bRはK中間体からL中間体を経ずに元に戻ることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Mikio Kataoka: "Recoverin alters its surface properties depending on both calcium-binding and N-terminal myristoylation" Journal of Biochemistry. 114. 535-540 (1993)
• [文献書誌] Daizo Hamada: "Intermediate conformational states of apocytochrome c" Biochemistry. 32. 10351-10358 (1993)
• [文献書誌] John M.Flanagan: "Mutation can cause large changes in the conformation of a denatured protein" Biochemistry. 32. 10359-10370 (1993)
• [文献書誌] Mikio Kataoka: "Trimeric mutant bacteriorhodopsin,D85N,shows a monophasic CD spectrum" FEBS Letters. 333. 111-113 (1993)
• [文献書誌] Kenichi Mihara: "Structural studies on the M intermediate with the use of mutant bacteriorhodopsin" Photomedicine and Phobobiology. 15. 69-74 (1993)
• [文献書誌] Ichiro Nishii: "Cold-denaturation of the molten globule state of apomyoglobin and a profile of protein folding" Biochemistry. 33(印刷中). (1994)