骨格筋弾性タンパク質コネクチンのクローニングと巨大タンパク質発現系の検討

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05740513
• 研究機関: (財)東京都臨床医学総合研究所
• 研究代表者: 丸山 敬 財団法人東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報研究部門, 研究員 (30211577)
• キーワード: コネクチン / チチン / 骨格筋 / クローニング / 弾性タンパク質 / 巨大タンパク質 / 筋原線維

研究概要

骨格筋の収縮はアクチンとミオシンの相互作用によるが、弛緩時には、構造蛋白質の一種である弾性蛋白質が重要である。これらの蛋白質の弾性により筋肉は、円滑に収縮と弛緩を行なうことができる。この蛋白質の代表が、筋肉の縦方向に走行する分子量300万を越える巨大なコネクチンである。このような巨大蛋白質のアミノ酸配列、遺伝子構造、生合成の過程は、通常の分子量20万以下の蛋白質とは異なる可能性があり、そのクローニングを試みた。
特異的抗体によりニワトリのコネクチンのcDNAのクローニングを試みた。その結果、3kbのpCN1と4kbのpCN3が得られた。どちらのクローンも、そのmRNAは非常に巨大であることがノーザンブロッティングで確認できた。pCN3は全長にわたるアミノ酸フレームが存在し、約1300個のアミノ酸をコードしていると考えられた。細菌でその一部を発現させ、ウサギで特異的抗体を作成した。その抗体は、ウエスタンブロッティングにてコネクチンを認識し、筋原線維のI帯の中間のN2ライン付近を染色した。また、pCN1は、配列から3末端側のクローンと考えられ、約800個のアミノ酸配列が推定された。合成ペプチドに対する抗体は、やはりブロッティングにてコネクチンを認識し、筋原線維のM線を染色した。以上結果から、このこれらのクローンはコネクチンのクローンであることが明かになった。
現在報告されているウサギ・コネクチン、ヒト心筋コネクチンなどの部分配列と比較すると、類似性は高いものの、相違点も見いだされた。今後はこの違いの意味について検討していきたい。さらに、巨大タンパク質のC末端とN末側のそれぞれにに特異的な抗体が得られたので、巨大ペプチドの合成速度の測定を次の課題としたい。

研究成果

• [文献書誌] Kei Maruyama,T.Endo,H.Kume,Y.Kawamura,N.Kanzawa,Y.Nakauchi,S.Kimura,K.Maruyama: "A Novel Domain Sequence of Connectin Localized at the IBand of Skeletal Muscle Sarcomers:Homology to Neurofilament Subunits" Biochemical and Biophysical Research Communications. 194. 1288-1291 (1993)