|
植物へ導入できるDNA断片のサイズは形質転換効率の良いアグロバクテリアを用いる系では、コスミドの機能を持つバイナリーベクターを用いても約30kbまでである。そこで、本研究ではよりサイズの大きいDNA断片を植物に導入可能な実験系を開発することを目的として、コスミドの2倍のサイズのDNA断片をクローン化できるP1クローニングベクターの機能を持つバイナリーベクターを作製した。
P1クローニングシステムの原理や操作はlambdaファージやコスミドのそれとほぼ同じでベクターを制限酵素で消化し、パッケージングに必要な領域を含む短アームとP1クローンDNAの複製に必要な領域を含む長アームを作製し、クローン化するDNAと連結して使用する。バイナリーベクターはアグロバクテリア内での複製に必要な領域や植物への導入に必要なT-DNA左右両境界配列などを持ち、導入したい外来DNAを両境界配列の間に挿入して使用する。しかし、P1クローニングベクターとバイナリーベクターの両方の機能に必要な領域を全て持つプラスミドは50kb近くになり取扱いが困難と予想されたため、本研究では、制限酵素消化により、アグロバクテリア内での複製開始領域、T-DNA左境界配列および植物内での選択マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ短アームを生じるプラスミドpBIP101と、T-DNA右境界配列およびマーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を持つ長アームを生じるプラシミドpBIP102を作製した。
現在このpBIP101とpBIP102のセットを用い植物や酵母のDNAのクローン化を試みており、期待される55-80kbのインサートを持つクローンが得られれば、それらを用いてアグロバクテリア内での安定性の検討や植物への導入実験を行う計画である。
|
