糖脂質結合型タンパク質の生合成および発作性夜間血色素尿症の病因研究

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05770803
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 宮田 敏男 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (10222332)
• キーワード: 発作性夜間血色素尿症 / PIG-A / GPIアンカー型蛋白 / 体細胞突然変異 / RT-PCR

研究概要

発作性夜間血色素尿症(PNH)は、溶血性貧血を主徴とする後天性血液疾患である。
私たちは、PNH患者由来欠損細胞株と同じ遺伝子に異常のあるヒトBリンパ球系欠損変異株を用いて、発現クローニングにより、これらの欠損変異株を正常株に転換する遺伝子PIG-Aを得た。本研究の目的は、PNH患者のPIG-A遺伝子を解析し、PIG-AがPNHの病因遺伝子であるかどうかを検討することにあった。
15例のPNH患者末梢血より多形核白血球を分離し、RT-PCRによりPIG-Aの翻訳領域を増幅しアガロース電気泳動にて解析した。その結果、3例は正常より小さなサイズを示し、11例は正常と同じサイズを示した。また1例の患者では全くPIG-Aのバンドが検出されなかった。
正常より小さなサイズの転写産物を示す3例の塩基配列を解析したところ、2例ともイントロンのスプライスサイトに点突然変異があることが明らかとなった。他の1例は、2番目のエクソンの3'部分が欠失した転写産物が主としてできていた。
次に正常と同じサイズのPIG-A転写産物を示す11例の患者において、これらのPIG-Aが正常の活性を有するかどうかトランスフェクションにより検討したところ、活性を持つクローンと活性を持たないクローンが存在しており、それぞれ正常細胞および異常細胞由来のクローンと考えられた。このうち2例の患者については、塩基配列の解析の結果、1例ではT残基の欠失が、もう1例ではA残基の挿入が活性を持たないクローンで認められた。残りの9例についてもトランスフェクションによって求めた活性のあるクローンとないクローンの割合は、FACS解析で求めた正常PMNと異常PMNの割合と非常に高い正の相関を有しており、翻訳領域に点突然変異が存在する可能性が強く示唆された。
以上、解析したすべてのPNH患者において、PIG-Aの量的あるいは質的異常を明らかにできた。この事実は、PIG-AがPNHの病因遺伝子であることを強く示唆すると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Takeda,J.,T.Miyata,K.Kawagoe,Y.Iida,Y.Endo,T.Fujita,M.Takahashi,T.Kitani,and T.Kinoshita.: "Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Cell. 73. 703-711 (1993)
• [文献書誌] Miyata,T.,N.Yamaka,Y.Iida,J.Nishimura,J.Takeda,T.KItani,& T.Kinoshita: "Abnormalities of PIG-A transcripts in granulocytes from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." New England Journal of Medcine. 330. 249-255 (1994)
• [文献書誌] Bessler M.,P.J.Mason,P.Hillmen,T.Miyama,N.Yamada,J.Takeda,L.Luzzatto and T.Kinoshita.: "Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria(PNH)is caused by somatic mutations in the PIG-A gene." EMBO Journal. 13. 110-117 (1994)