相同組換えの中間体解離酵素RuvCエンドヌクレアーゼの解析

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 05780500
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 岩崎 博史 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (60232659)
• キーワード: 相同組換え / Holliday構造 / RuvC / エンドヌクレアーゼ / DNA修復 / DNA結合蛋白質 / RecABタンパク質 / RuvAタンパク質

研究概要

相同組換えの中間体と考えられているHolliday構造は二分子の二重鎖DNAがそれぞれ相補鎖を交換してX字型構造となった構造をしている。この中間体がDNAの交差部位で切断されると組換え体が生じると考えられており、我々は、RuvCタンパク質はこの反応に関与するエンドヌクレアーゼであることを証明してきた。本研究では、RuvCエンドヌクレアーゼの作用機序を明かにすることを目的とし、合成オリゴヌクレオチドで作成したHolliday構造のモデル基質を用いて解析した。その結果以下のことを明かにした。
○RuvCは、4本の単鎖DNAが互いに交差しX字型となった構造のジャンクションに特異的に結合し、Y字型DNAや通常の二重鎖DNAに対するアフィニティーは弱い。
○RuvCは、X字型DNAのジャンクションに相同性がある場合のみ切断するが、相同性の有無は結合反応に影響しない。
○切断反応にはMg^<++>などの2価の陽イオンを必要とするが、結合反応は陽イオンの要求性はない。
○Y字型DNAは結合アフィニティーが弱いにもかかわらず、X字型DNAと同様に良く切断された。但し、この場合もY字型DNAのジャンクションに相同性が必要であった。
以上のこと等から、RuvCエンドヌクレアーゼの作用機序について次のように提案した。RuvCのHollidayジャンクション対する結合と切断反応は、独立したモードである。相同性を持つ場合のみX字型及びY字型DNAが切断されるということから、合成Holliday構造の取り得る特殊なトポロジーの場合のみRuvCの基質となると考えられる。このことは、真のHollidayジャンクションの構造を理解するうえで重要なキ-となると思われる。

研究成果

• [文献書誌] Shiba,T.,et al.: "Escherichia coli RuvA and RuvB proteins involved in recombination repair:physical properties and interactions with DNA." Mol.Gen.Genet.237. 395-399 (1993)
• [文献書誌] Shinagawa,H.,et al.: "SOS-inducible recombination repair genes:Products of the ruvA,ruvB,and ruvC genes are Holliday junction specific enzymes." Shima,A.et al.,editors.“Frontiers of Photobiology"Elsevier Science Publishers. 図書総頁528頁. 323-327 (1993)
• [文献書誌] Shida, T., et al.: "Structural analyses of synthetic immobile Holliday junction" Nucleic Acids Symposium Series. 29. 181-182 (1993)
• [文献書誌] Takahagi,M.,et al.: "Structural requirement of substrate DNA for binding to and cleavage by RuvC,a Holliday junction resolvase." J.Biol.Chem.(印刷中). (1994)