| 研究概要 |
大腸菌K-12株で発見したRT遺伝子を含むDNAをプローブとしてサザンブロッテイング法で調べ、大腸菌K-12株には1コピーの、C株には少なくとも5コピーのRT遺伝子が存在し、大腸菌B株、S.dysenteriae,S.typhimurium,K.pneumoniae,S.marcescens,P.mirabilis,Ps.putidaには存在しないことを明らかにした。C株よりRT遺伝子を含む2kbのDNA断片をクローニングし、塩基配列を決定してK-12株との比較を行った結果以下のことが明らかになった。1)K-12株ではRTは322個のアミノ酸より構成されていたが、C株においては499個のアミノ酸より構成されておりN-末端側の322個のアミノ酸配列はK-12株と同じである。2)K-12株ではRT遺伝子の下流にIS5が連結して存在しているが、C株ではIS629が連結して存在している。
またRTの活性を明かにするために、RT遺伝子の存在が明らかになったK-12株、C株およびRT遺伝子を持たないB株の粗抽出液を用いてのRT活性の測定を試みたが各菌株間での有意義な差は検出できなかった。RT活性測定法に関しては一般的にHIV等のRT活性測定法として行なわれているPoly(rA)-oligo(dT)を鋳型プライマーとして標識dTTPの取り込み率を調べる方法を試みたが活性は検出できなかった。この方法ではDNAポリメラーゼのもつRT活性が高いため各株間の差が検出できないと思われる。Pol I温度感受性変異株を用いても同様の結果を得た。T7プロモーターをもちいてRTの多量発現系を構築したが、産生されたRTは細胞内で不溶化してしまい精製できなかった。現在グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合遺伝子を作成しアフィニテイゲルを用いて融合タンパクの精製を行なっているが融合タンパクのゲル結合能が低いことやファクターXaで切断したときに分解されやすいなどの問題がある。
E.coli C株においてコピー数が多いことはC株のRTがレトロトランスポゾン上にあることが考えられる。トランスポジションアッセイ用ベクターを用いてC株のRTがトランスポジションするか否か検討中である。
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