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1.ヒトRAG-1mRNA発現検出法の確立
RT-PCR法による検出は高感度であるが、非特異的な反応も起こりやすい。我々は、種々の条件を検討し、RAG-1mRNA発現を高感度かつ特異的に検出する方法を確立した。条件は次のとおりである。
センスプライマー:1-20、アンチセンスプライマー:213-232、アニーリング:55℃2分、サイクル数:30
この系を用いて、正常細胞および血液系細胞株におけるRAG-1の発現を検索したところ、胸線、骨髄・臍帯血中の単核球、プレB細胞株(Nalm6)、T細胞株(CEM)といった未熟リンパ組織でRAG-1の発現が見られた。また、我々の樹立したヒトリンパ球前駆細胞株(FL細胞)においてはRAG-1mRNAの発現は見られず、FL細胞がRAG-1を発現する以前の細胞であることがわかった。
2.FL細胞に対するRAG-1発現誘導
マウスストローマ細胞株であるPA-6と共培養することによって、FL細胞にRAG-1の発現が誘導された。このRAG-1発現の誘導にはサイトカインの存在が必要であり、そのサイトカインがIL-3、IL-6、IL-7であることを明らかにした。これらは各々単独でもRAG-1の発現を誘導するが、三者が共存するとより強い誘導活性を示す。この系で、メンブレンフィルターを用いてFL細胞とPA-6との物理的接触を阻害するとRAG-1発現誘導は全く見られなくなる。またマウス線維芽細胞NIH3T3との共培養ではRAG-1は誘導されない。これらのことからFL細胞に対するR発現誘導にはサイトカインとPA-6細胞膜上の分子からのシグナルが必要であることが明らかになった。
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