|
ウシ永久歯歯髄培養細胞の培養1週目(歯髄細胞)および培養4週目(前象牙芽細胞)よりAGPC法を用いてRNAを分離し、オリゴ(dT)セルロースを用いてpoly(A^+)RNAを抽出した。後者のcDNAをオリゴ(dT)をプライマーとして作製し、前者のpoly(A^+)RNAとハイブリさせ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィによりハイブリしなかったcDNAを回収した。このcDNAより、lambdaZAPIIベクターおよびUni-Zap XRキット(Stratagene)を用いてサブトラクションライブラリーを作製した。ファージcDNAライブラリーはEx Assist 1 SOLR system(Stratagene)を用いてp Bluescript phagemid cDNAライブラリーに交換した。自動DNAシーケンサを用いて無作為に選択した50個のクローンの部分DNAシーケンスを決定した。シーケンスホモロジーは Gen BankデータベースおよびPIRプロテインデータベースで検索した。そのうち、15個はデータベースのものと一致し、5個は転写因子や細胞表面受容体のような遺伝子と類似していた。25個は未知の遺伝子であった。このうち5個をPGEM-Tベクター(Promega)にサブクローニングし、SP-6およびT7ポリメラーゼを用いてRNAプローブを作製した。ウシ永久歯歯胚パラフィン切片を用いて、in situ hybridizationを行い、mRNA発現部位を検索した。しかしながら、目的とする象牙芽細胞に特異的に発現されているクローンは見つけられなかった。現在、他の20個の未知の遺伝子に関してin situ hybridizationにて検索中である。
|
