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胚性幹(ES)細胞は体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期に培養することが可能である。分化多能性の維持にはOct3/4、Sox2、Nanog、Klf4およびSTAT3などの転写因子が必須であることが知られている。しかしこれらの転写因子が制御する標的遺伝子に関しては、ほとんどわかっていない。本研究の目的は、クロマチン免疫沈降法とDNAマイクロアレーを組み合わせたいわゆるChip on Chip法により、ES細胞の多能性維持に関わる転写因子群の標的遺伝子を探索することである。
本年度の成果
クロマチン免疫沈降法の最適化
各転写因子に対する抗体に関して、反応時間、温度、洗浄バッファーの組成、沈降法(遠心またはマグネティックビーズの吸着)を検討し、最適のクロマチン免疫沈降法を決定した。抗体も複数種類を購入に、最良の結果が得られるものを検討した。
DNAマイクロアレー法の最適化
マイクロアレーとして、アジレント社から発売予定のもの、およびカスタムメードで作製するものを比較した。ハイブリの温度、洗浄条件などを検討し、シグナルとノイズの比が最良の条件を決定した。
またクロマチン免疫沈降法の後にPCRを行う通常の方法と比較することにより、Chip on Chip法の解析結果がどれくらい信頼できるかを評価した。またゲルシフト法により、実際に転写因子がゲノムDNAに結合することを確認した。
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