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エンドサイトーシスによって細胞内部に取り込まれた物質は、エンドソームにおいて輸送先に応じた選別を受けることが知られている。本研究では、物質の選別過程で機能するESCRTタンパク質複合体に対し、Alix及びそのカルシウム依存的な相互作用因子であるALG-2が関与する分子メカニズムとその生理的意義の解明を目的としている。
前年度の解析によってAlixおよびAlixホモログであるBroxはそれぞれのBrolドメインを介してESCRT-III構成因子であるCHMP4と直接相互作用していることを明らかにしており、さらなる相互作用解析を行った。その結果、CHMP4とBroxの相互作用は直接の相互作用であることを明らかにしたものの、酵母Two-Hybrid法及びMS解析ではその他の相互作用因子の同定は達成できなかった。
Alixがエンドサイトーシスに関与することが既に判明していたため、同様にBroxもエンドサイトーシスに関与すると推測し、解析を行った。培養細胞に一過的に発現させたGFP融合Broxは様々なエンドソームマーカータンパク質とは共局在しなかったものの、アミノ末端領域欠損変異体はEGF刺激存在下においてエンドソームマーカーであるEEA1およびLamp-1と共局在することが明らかになった。このことから、Broxは細胞が特定の刺激を受けた時に、エンドソーム上に一過的に移行し、機能を果たすことが推測される。また併せて、エンドソームからの解離にはアミノ末端領域が重要な役割を担っていることが推測される。
Broxはカルボキシ末端領域に脂質修飾を受けることが予測されるCAAXモチーフを持っており、他の生物種に存在するオーソログにおいても保存されていることから、細胞膜への移行にはC未の脂質修飾が必要であることが考えられた。そこで、CAAXモチーフを変異させた点変異体を作成し、培養細胞に発現させたところ、一部の変異体で膜に局在しなくなる現象が観察された。このことから、細胞膜への移行にはCAAXモチーフが重要であることが実証された。
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