レーザー・蛍光色素法による細胞の可視化計測とエイズ免疫、癌診断、治療への応用

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06044027
• 研究機関: 茨城大学
• 研究代表者: 藤井 寛一 茨城大学, 工学部, 教授 (00054354)
• 研究分担者: GUSTAFSOR T. カリフオルニア大学, バークレイ校・工学部, 教授 ; AMANO M. スタンフオード大学, メディカルセンター, 実験講師 ; KIYONO H. アラバマ大学, バーミングハム校・メディカルセンター, 教授 ; SCHAWLOW A.L スタンフオード大学, 理学部, 教授 ; MCCUTCHEON M アラバマ大学, バーミングハム校・工学部, 教授 ; MCGHEE J.R. アラバマ大学, バーミングハム校・メディカルセンター, 教授 ; 石川 悟 日立総合病院, 泌尿器科, 主任医長 ; 岡 裕爾 日立総合病院, 内科, 主任医長 (20160658) ; 妻鹿 純一 日本大学, 松戸歯学部, 講師 (40190946) ; 久保田 俊夫 茨城大学, 工学部, 講師 (40143143) ; 亀丸 俊一 茨城大学, 工学部, 助教授 (60175289) ; 白石 昌武 茨城大学, 工学部, 教授 (10091860)
• キーワード: バイオメディカル / ILISPOT法 / 免疫学 / 粘膜免疫機構 / 抗原特異抗体 / 免疫担当細胞 / T細胞 / サイトカイン

研究概要

レーザー工学ならびにバイオメディカル工学のコンセプトを免疫学に適用し、特にこの分野の中で新世界ともいわれる粘膜免疫機構を分子・細胞レベルで解析する目的から、新しいILISPOT法が本研究で開発された。この方法を利用して、テニスコート1.5面分に相当するヒト粘膜面に存在するT細胞、B細胞などの各種免疫担当細胞を単一細胞レベルで調べる事が可能になった。つまり、経口投与したワクチン抗原に対する抗原特異的IgM,IgGそしてIgAの頻度を客観的にかつ正確に調べられる。また、広大な粘膜免疫担当組織の中で、どの部位に的確に抗原特異抗体産生細胞が経口免疫により誘導されるかも簡単に同定出来る。
現在はこのシステムを完全自動化する為に、新しい付属器具そしてソフト用のプログラムの開発を進めている。さらに、免疫担当細胞としてもう一つの大切なT細胞から産生されるサイトカインについても、単一細胞レベルで解析出来る様、システムの向上をはかっている。
具体的には、茨城大学側で発光強度の大きい蛍光色素および含フッソリンカーアームの開発とプローブに高密度で結合する蛍光色素の開発を行い、共同研究先であるアラバマ大学メディカルセンター及びスタンフォード大学メディカルセンターに持参して共同実験に供した。
コレラトキシン(CT)は、粘膜領域において産生される抗原特異的なIgAの誘導に優れたアジュバントと考えられている。しかし、その投与が粘膜領域においてポリクローナルな免疫応答を示すのか、あるいは抗原特異的なIgA反応を示すのかは不明である。これまでこのような疑問点を明らかにする手法としてELISPOT法が用いられて来たが、共同研究者であるスタンフォード大学、Dr.Amanoにより開発され、改良されているILISPOT-IDIP法を応用し、将来、将来両者を比較検討する事を目的として以下の実験を行った。
(1)CTによる感作:Germ-free mouseに対し、CTを経口投与ならびに経腸投与した。また、投与量による応答を比較検討するため、各投与ごとに1μgおよび10μg投与群を設定し、2次感作から1週間後にと殺し、実験に供した。
(2)Mononuclear cell 採取部位:脾臓、大腸、小腸。ただし小腸についてはその全長を3等分し、分析を行った。
(3)可験試料:血清および糞便。
(4)体液性免疫応答:ELISA法及びELISPOT法により吟味した。
これらの検討から、Germ-free mouseでは経粘膜経由で投与されたCTにより抗原特異的な免疫応答が誘導される事が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] M.Amano,J.C.Martin,J.R.McGhee,M.J.McCutcheon and H.Kiyono: "Immunofluorescence-digital image process-ing system for the quantitation of secreted immunogloblin by single cells" Journal of Immunological Methods. 144. 127-140 (1991)
• [文献書誌] M.Amano,J.R.McGhee,M.J.McCutcheon,K.Fujii and H.Kiyono: "Application of the ILISPOT-IDIP system for the enumeration of different sizes of IgA spot forming cells in the murine" Jounal of Immunological Methods. 164. 79-90 (1993)
• [文献書誌] M.Amano,J.Maga,H.Kiyono,J.R.McGhee et al: "Immunofluorescence digital image analysis reveals a compertmentalized common mucosal immune system" International Immunology. (under contribution).
• [文献書誌] J.Mega,M.Amano,H.Kiyono,J.R.McGhee et al: "Influence of mucosally administrated cholera toxin for antigen-specific and polyclonal B cell responses" 8th International Congress of Mucosal Immunology (Sandiego,U.S.A.,July 16-20,1995). (to be published).
• [文献書誌] K.Fujii,X.Guang,M.Amano,H.Kiyono et al: "Mode control of semiconductor laser with diffraction and dispersion feedbacks" 12th International Conference on Laser Interaction and Related Plasma Phenomena(Osaka,Japan,April 24-28,1995). (to be published).
• [文献書誌] M.Takashima,K.Fujii,M.Amano,H.Kiyono et al: "Control of siglet-triplet transition in negative glow plasma in Ne gas with optogalvanic laser spectroscopy21GC06:International Conference on Gas Discharge and Their Applications-1995(Tokyo,Japan,September 11-15,1995)" (to be published).