核磁気共鳴法によるカルサイクリンとアネキシンXI分子の高次構造解析

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06044105
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 日高 弘義 名古屋大学, 医学部, 教授 (80100171)
• 研究分担者: LUBIENSKI Mi スクリスプ研究所, 研究員 ; POTTS Barbar スクリプス研究所, 研究員 ; CHAZIN Walte スクリプス研究所, 教授 ; 渡辺 泰男 名古屋大学, 医学部, 助手 (10273228) ; 仁木 一郎 名古屋大学, 医学部, 助教授 (10262908)
• キーワード: カルサイクリン / アネキシン / カルシウム結合蛋白質 / 核磁気共鳴法 / 高次構造

研究概要

昨年度、カルサイクリン分子の高次構造をNMR法を用いて解析し、EF-hand構造を二つもつカルシウム結合蛋白のS100蛋白ファミリーに普遍的な二量体形成機構を解明し、報告した(Natl.Struct.Biol.2.790-796.1995)。本年度は、さらにこの二量体形成機構に着目し、S100蛋白ファミリーの中で唯一二量体を形成しえないカルビンディンD_<9k>の構造解析を、カルサイクリン分子と比較分析することにより行った。その結果、カルビンディンD_<9K>は他のS100蛋白ファミリーよりもN末端、C末端のアミノ酸がそれぞれ一部欠損しており、C末端のアミノ酸の欠損が二量体形成に重要なHel ix IVの構造に変化を与え、そのため単量体としてのみ存在していることが示された(Protein Sceince 5.2162-2174.1996)。他方、本年度はカルサイクリンとそのリガンドであるアネキシンXIの蛋白-蛋白相互作用を高次構造解析により解明すべく、アネキシンXIのカルサイクリン結合部位の同定、およびその結合ペプチドの探索を行った。種々のアネキシンXIのアミノ酸配列とGST蛋白との融合蛋白を分子生物学的手法を用いて作成し、カルサイクリン分子との相互作用を検討した。その結果、カルサイクリンはアネキシンXIのGln49からThr62の領域に結合することが示された。この領域はα-ヘリックス構造をとり、この領域内の疎水生残基とカルサイクリンの疎水生残基が相互作用を起こすことにより、アネキシンXIがカルサイクリンと結合することが示された。この結合様式は他のアネキシンとS100蛋白でも報告されており、アネキシン-S100の相互作用に普遍的な機構であることが示唆された。また、このカルサイクリン結合部位を含む合成ペプチドを作成し、このペプチドがアネキシンXIとカルサイクリンの相互作用を阻害すること、すなわちカルサイクリンに結合することを示した。現在、カルサイクリンにこの合成ペプチドを反応させたときのカルサイクリン分子の高次構造をNMR法を用いて解析中である。この解析結果から、本研究の最終目的であるカルサイクリン-アネキシンXI複合体の高次構造が解明されるものと思われる。

研究成果

• [文献書誌] B.C.M.Potts: "^1H NMR assigments of apo calcyclin and comparative structural analysiswith calbindin D9k and S100β." Protein Science. 5. 2162-2174 (1996)
• [文献書誌] I.Niki: "Ca^<2+> signaling and intracellular Ca^<2+> binding Proteins." J.Biochem.120. 685-698 (1996)
• [文献書誌] T.Sudo: "Isoform-specific intracellular vesicle formation by recombinant annexin XI-A in Sf9 cells." Biochem.Biophys.Res.Commun.223. 706-711 (1996)
• [文献書誌] B.C.M. Potts: "The structural of calcyclin revesls a novel homodimeric fold for S100Ca^<2+>-binding proteins." Nature Structural Biology. 2. 790-796 (1995)
• [文献書誌] T.Hoshino: "Plant annexin form homodimer during Ca^<2+>-dependent liposome aggregation." Biochemistry and Molecular Biology Internationanl. 35. 749-755 (1995)
• [文献書誌] A.Mizutani: "The long amino-terminal tail domain of annexin XI is necessary for its nuclear localization." Arch.Biochem.Biophys.318. 157-165 (1995)
• [文献書誌] N.J.Skelton: "Determination of the solution structure of Apo calbindin D9k by NMR spectroscopy." J.Mol.Biol.249. 441-462 (1995)
• [文献書誌] C.Weber: "High lebel expression in Escherichia coli and characterization of theEF-hand calcium-binding protein caltration." J.Biol.Chem.269. 15795-15802 (1994)
• [文献書誌] N.Mamiya: "Development-related and cell-type specific nuclcar localization of annexin XI:immunolocalization analusis in rat tissues." Biochem.Biophys.Res.Commun.202. 403-409 (1994)
• [文献書誌] K.Okazaki: "A role of calcyclin,a Ca^<2+>-binding protein,on the Ca^<2+>-dependent insulin release from the pancreatic β cell." J.Biol.Chem.269. 6149-6152 (1994)
• [文献書誌] H.Hidaka: "Annexins:Molecular Structure toCellular Function" Chapman & Hall, 245 (1995)
• [文献書誌] H.Hidaka: "Calcium as Cell Signal" Igaku-Shoin, 293 (1995)