植物の自家不和合性に関与するRNase

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06044141
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 崎山 文夫 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (40029947)
• 研究分担者: エイドリアン E.クラー メルボルン大学, 植物学部, 教授 ; 李 紹良 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (40252720) ; 佐藤 衛 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (60170784) ; 乗岡 茂巳 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (70198638)
• キーワード: 自家不和合性 / S-RNase / 非S-RNase

研究概要

タバコ(Nicotiana alata)のS6-RNaseの触媒活性の発現に必須なアミノ酸残基を決定するため、化学修飾法により検討した。モノヨード酢酸による修飾により、酵素は著しく失活したが、、2'-GMP(競争阻害剤)存在下の修飾では失活がおさえられた。失活した酵素のプロテアーゼ消化物を分析したところ、システイン、メチオニン残基の修飾が認められたが、ヒスチジン残基の修飾は検出されなかった。修飾残基として、95位システイン残基のS-カルボキシメチル化を確認した。メチオニン残基については、失活が抑制された2'-GMP共存下の反応でも同様の修飾が認められたので、活性発現には関与しないと結論した。つぎに、ヒスチジン残基の関与を調べるため、特異的試薬であるジエチルピロカルボネート(DEPC)による修飾を行なったところ、S6-RNaseは修飾が進むにつれて活性を失った、修飾生成物デラウN-Im-エトキシカルボニルヒスチジン残基は化学的に不安定であるので、質量分析計を用いて修飾残基を含むペプチドを迅速(2時間以内)に単離・同定する新しい方法を考案し、それを用いて分析を行なった。その結果、31位のヒスチジン残基の修飾により、この酵素は完全に失活することが明らかになった。S1-RNaseの結晶化に成功し、X線構造解析を開始した。ナシ(Pyrus pylifolia)の花柱由来の3種類のRNasc(S2-、S4-、non-S-)の遺伝子をクローン化し、アミノ酸配列を決定した。平成6年度は、日豪間で合計4名(日3、豪1)の相互訪問を行い、N.alata,P.pyrifoliaの自家不和合性に関与するRNaseについて研究打合せおよび調査を行なった。

研究成果

• [文献書誌] Takeshi Ishimizu,Masaru Miyagi,Shigemi Norioka,Ying-Hong Liu,Adrienne E.Clarke and Fumio Sakiyama: "Identification of histidine 31 and cysteine 95 in the active site of selfincompatibility associated S_6-RNase in Nicotiana alata" European Journal of Biochemistry. (予定).
• [文献書誌] Naoko Norioka,Yoshimi Ohnishi,Shigemi Norioka,Takeshi Ishimizu,Tetsu Nakanishi and Fumio Skiyama: "Nucleotide sequences of cDNAs encoding S_2-and S_4-RNases from Japanese Pear(Pyrus pyrifolia Nakai)" Plant Cell. (予定).
• [文献書誌] 崎山文夫: "顕花植物の自家不和合性の分子機構" 学術月報. 47. 347-352 (1994)
• [文献書誌] 崎山文夫: "雌芯のリボヌクレアーゼと自家不和合性" 蛋白質・核酸・酵素 増刊「化学から生物学へ」. 40. 293-303 (1995)
• [文献書誌] Satoshi Kuroda,Shigemi Norioka,Masanori Mitta,Ikunoshin Kato and Fumio Sakiyama: "Primary structure of a novel stylar RNase unassociated with self-incompatibility in tobacco plant,Nicotiana alata" Journal of Protein Chemistry. 13. 438-439 (1994)