遺伝子情報維持に関与するタンパク質カスケードの解明

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06263202
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 内田 和彦 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (90211078)
• キーワード: ポリADP-リボシル化 / DNA修復 / タンパク質相互作用 / ショウジョウバエ

研究概要

ポリADP-リボース合成酵素が、DNA損傷部位に結合してから種々のタンパク質に相互作用し、細胞周期のG1もしくはG2停止を促し、その結果DNA修復がスムーズに行なわれるのではないかという作業仮説のもとに、免疫沈降法とWest-westernblotting法を用いて本酵素と相互作用するタンパク質の同定を試みた。またin vivoでポリADP-リボース合成酵素がどのように機能しているかを、ショウジョウバエで本酵素遺伝子の欠損した変異体の単離を試み、その表現形質を解析した。
成果:[方法]1)ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素に対する抗体を作成し免疫沈降に用いた。ロイシンジッパーを含む自己修飾ドメインのGST融合タンパク質をプローブに用いて細胞粗抽出液に対するWest-western blottingとλgt11 cDNAライブラリーのスクリーニングを行なった。2)唾腺染色体を用いたin situハイブリダイゼーション法で本酵素遺伝子の染色体上の位置を同定し、すでに報告されている欠失変異体を解析した。[結果]1)ショウジョウバエKC細胞の粗抽出液を抗ショウジョウバエポリADP-リボース合成酵素抗体にて、123、116、92、77、63kDaのタンパク質が共沈した。同様にWest-western blotting法にて結合するタンパク質を検出した。West-western blotting法によるcDNAライブラリーのスクリーニングにより60万個の中から、19個のクローンを単離した。得られたクローンにコードされるタンパク質は、ポリADP-リボース合成酵素とヘテロダイマーを形成すると考えられた。2)ポリADP-リボース合成酵素は第3染色体にマップされた。同領域に欠失をもつ変異体のうち、2つの変異体が本酵素遺伝子の一部のみを欠失しており、これらのホモ接合体は成虫になることができず、発生のいずれかの段階で死ぬことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Hori,M.: "Intrauterine transmission of human T-cell leukemia virus tipe 1 in rats." J.Virol.69(2). 1302-1305 (1995)
• [文献書誌] Uchida,K.: "Poly(ADP-ribose)polymerase: Structural conservation among different classes of animals and its implications." Mol.Cell.Bioochem.138. 25-32 (1994)
• [文献書誌] Suzuki,H.: "Ki-ras mutations in pancreatic secretions and aspirates from two patients without pancreatic cancer." J.Natl.Cancer Inst.,. 86(20). 1547-1549 (1994)
• [文献書誌] Kushida,S.: "High incidence of HAM/TSP-like symptoms in WKA rats after administration of human T-cell leukemia virus type 1-producing cells." J.Virol.68(11). 7221-7226 (1994)
• [文献書誌] Mizusawa,H.: "A neuropathological study of paraparetic rats injected with HTLV-1-producing T cells." J.Neurol.Sci.126. 101-108 (1994)
• [文献書誌] Ichikawa,Y.: "Mutation of K-ras protooncogene is associated with histological subtypes in human mucinous ovarian tumors." Cancer Res.54. 33-35 (1994)