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大腸菌RNAポリメラーゼは機能的に2つの領域に分けられる。すなわちN末端領域(アミノ酸残基21-235)がRNAポリメラーゼのサブユニット集合に重要な役割を果たし、C末端領域(アミノ酸残基236-329)は数多くのクラスI転写因子による転写活性化に関与している。今年度はN末端領域に欠失、挿入、アミノ酸置換を持つ変異体を多数作成し、in vitro再構成系を用いて機能の解析を行なった。その結果αサブユニットのN末端領域にβサブユニット、β'サブユニットとの相互作用に重要な部位をそれぞれ同定することができた。一方C末端領域については、CRP(cAMP受容蛋白)およびエンハンサーエレメント(UPエレメント)との相互作用に重要と思われる260-270アミノ酸残基の領域に集中的にアミノ酸置換変異を導入し、変異体RNAポリメラーゼを再構成してそれらの機能を解析した。その結果265番目のArgがCRPおよびUPいずれとの相互作用にも重要な役割を果たしていることがわかった。2つの機能領域が構造とどのように関わっているかを調べるため、プロテアーゼ限定分解による解析を行なった。トリプシン、V8プロテアーゼいずれの場合にも、最初の切断部位はアミノ酸残基240付近に集中しており、構造的にも2つの独立したドメインから構成されていることがわかった。現在、転写活性化ドメイン(アミノ酸残基233-239)を単独で発現、精製し、NMRによる構造解析をすすめている。
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