標的遺伝子組換えによるミューテーター(高突然変異)マウスの作製とその発癌への影響

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06280222
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 續 輝久 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (40155429)
• 研究分担者: 早川 浩 九州大学, 医学部, 助手 (70150422)
• キーワード: 標的遺伝子組換え / 胚性幹細胞(ES細胞) / ジーン・ターゲティング / DNA修復酵素 / 相同的組換え / 変異マウス

研究概要

これまでの研究の結果、酸素による遺伝子DNA上の障害の中で、活性酸素によって生じる8-オキソグアニンの自然突然変異の生起に大きく影響し、それを取り除く8-oxo-dGTPase等の酵素系哺乳動物においてもDNA上の傷害防止に極めて重要な役割を果たしていることを明らかにした。活性酸素に伴うDNA上の傷と自然突然変異および発がんの関連を明らかにし、その過程を分子レベルで解明することを目的に、標的遺伝子組換えの手法により8-oxo-dGTPase遺伝子の変異細胞・変異マウスを作製することを試みた。
(1)ヒトの染色体DNAを単離し構造を解析した。その結果ヒトの8-oxo-dGTPaseの遺伝子(MTH1命名)は約9kbの大きさで、少なくとも4つのエクソンから成ること、染色体の7p22に位置していることを明らかにした。(2)マウスのcDNA及び染色体DNAを単離して解析し、標的遺伝子組換えのためのターゲティング・ベクターを構築した。これをマウスES細胞に導入後、ポジティブ・ネガティブ選別で生えてきたコロニーを解析し目的とする複数の細胞クローンを得た(ヘテロ)。(3)これら細胞株を高濃度のG418存在下に培養を行ない、対立遺伝子の両方が不活化した細胞株(ホモ)を単離した。(4)また対立遺伝子の片方の遺伝子を不活化した細胞をマウスの胚盤胞に導入し、キメラマウスを経て変異マウスの樹立を行っている。
現在得られた変異細胞株(ヘテロ・ホモ)については、正常細胞と比較してhprt遺伝子座での突然変異率(6-TG耐性コロニーの出現頻度)や変異の種類の解析を行う予定てある。また変異マウス系統についてはコロニーを確立後、欠損個体における種々の生物学的指標や突然変異率・発がん率の検討を行うことを計画している。

研究成果

• [文献書誌] Kenji Ihara: "Requirement of the Pro-Cys-His-Arg sequcnce for O^6-mcthylguanine-DNA mcthyltransferase activity rcvealed by saturation mutagenesis with negative and positive screenig." Molecular General Genetics. 243. 379-389
• [文献書誌] Toru Ishibasi: "Intracellular localization and function of DNA repair methyltrandferase in human cells." Mutation Research. 315. 199-212
• [文献書誌] Masato Furuichi: "Genomic structure and chromosome location of the human mutThomologue gene MTH1 encoding 8-oxo-dGTPase for prevention of A:T to C:G transversion." Genomics. 24. 485-490
• [文献書誌] Derrick E.Rancourt: "Genetic interaction between hoxb-5 and hoxb-6 is revealed by nonallelic noncomplementation." Genes & Development. 9. 108-122
• [文献書誌] Hiroshi Hayakawa: "Generation and elimination of 8oxo-7,8-dihydro-2'-depxyguanosine 5'-triphosphate,a mutagenic substrate for DNA synthesis,in human cells." Biochemistry. 34. 89-95
• [文献書誌] 續 輝 久: "ヒト突然変異抑制遺伝子のクローニングとその機能" 日本臨牀. (印刷中).