新規がん抑制遺伝子の単離とその性状の解析

1994 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 06280247
• 研究機関: 千葉県がんセンター
• 研究代表者: 崎山 樹 千葉県がんセンター, 研究局, 局長 (30260243)
• 研究分担者: 尾崎 俊文 千葉県がんセンター, 研究局・生化学研究部, 研究員 (40260252)
• キーワード: がん抑制遺伝子 / 細胞周期 / 分泌タンパク質

研究概要

1)ラットの培養細胞系で見い出されたがん抑制の候補遺伝子DANのヒト対応遺伝子の単離・構造解析を行うため、ヒトリンパ球由来のゲノムライブラリーをEMBL3ファージで作成しDANcDNAをプローブにしてスクリーニングした。現在、全長約16KBのクローンを得、DANcDNAとハイブリダイズする領域(約5.6KB)を中心にその構造解析を行っている。神経芽細胞腫で構造異常をおこしていると想定されるcDNAの5側非翻訳領域に対応する配列は現在のところ未同定である。
2)ラットDANcDNAを3Y1細胞にトランスフェクトし、DAN遺伝子を強制発想させたクローンでは、親株または発現ベクターのみを導入した細胞にくらべて細胞数倍加時間の延長と飽和密度の顕著な減少を示した。また、非同調系培養での細胞周期間での細胞数分布をFACScanにて調べたところ、親株のG1期細胞が約24%であるのに対して、DAN高発現細胞では40-58%とG1期の延長が見られた。血清の飢餓および再添加による細胞周期の同調系でさらに詳細な検討を行ったところ、DAN高発現クローンにおいてG1-S期の移行に遅れの見られることが判明した。
3)大腸菌内でマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として生合成させた後、精製したDANで家兎を免疫し、抗DAN抗体を得た。アフィニテイー精製した抗体を用いて、免疫沈降法、Western法により細胞内分布を検討したところ、DANは核画分には存在せず、細胞質に限局することが判った。さらに、DANのN末端側25残基のアミノ酸は疎水性に富むことから、細胞外へDANが分泌される可能性が示唆された。事実、3Y1細胞の培養液中にはDANタンパクが検出され、細胞が産生するDANのうち約70-80%が分泌されることが判明した。

研究成果

• [文献書誌] Ozaki,T.: "Overexpression of DAN gene product in normal rat fibroblasts causes a retardation of the entry into the S phase." Cancer Res.55. 895-900 (1995)
• [文献書誌] Enomoto,H.: "Identification of human DAN gene,Mapping to the putative neuroblastoma tumor suppressor Iocus." Oncogene. 9. 2785-2791 (1994)
• [文献書誌] Ozaki,T.: "Complex formation between lamin A and the retinoblastoma gene product:Identification of the domain on lamin A required for its interaction." Oncogene. 9. 2649-2653 (1994)
• [文献書誌] Sakiyama,S.: "Molecular cloning and characterization of a cDNA showing tumor-suppressive activity in v-src-transformed 3Y1 rat fibroblasts." Adv.Enz.Regul. 34. 247-255 (1994)
• [文献書誌] Ozaki,T.: "Tumor-suppressive activity of N03 gene product in v-src-transformed rat 3Y1 fibroblasts." Cancer Res. 54. 5646-5648 (1994)